THO VIET - CXCL5 kích hoạt CXCR2 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm để gây đau khớp và viêm trong viêm khớp do gút thực nghiệm

Tổng quan

Viêm khớp do gút gợi lên đau khớp và viêm. Các cơ chế thúc đẩy đau và viêm bệnh gút vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Ở đây chúng tôi chỉ ra rằng CXCL5 kích hoạt CXCR2 biểu hiện trên các tế bào thần kinh cảm giác về đêm để điều khiển cơn đau và viêm gút. Biểu hiện CXCL5 tăng lên ở khớp mắt cá chân của chuột mô hình viêm khớp do gút, trong khi CXCR2 cho thấy biểu hiện ở các tế bào thần kinh cảm giác bẩm sinh khớp. CXCL5 kích hoạt CXCR2 biểu hiện trên các tế bào thần kinh cảm giác về đêm để kích hoạt TRPA1, dẫn đến tăng kích thích và đau. CXCR2 tế bào thần kinh phối hợp với CXCR2 bạch cầu trung tính để góp phần gây ra hóa trị bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra thông qua kích hoạt giãn mạch qua trung gian CGRP và chất P và thoát mạch huyết tương. Xóa Cxcr2 thần kinh giúp cải thiện đau khớp, thâm nhiễm bạch cầu trung tính và suy giảm dáng đi ở chuột mô hình. Chúng tôi đã xác nhận biểu hiện CXCR2 trong tế bào thần kinh hạch rễ lưng ở người và tăng mức CXCL5 trong huyết thanh từ bệnh nhân nam bị viêm khớp do gút. Nghiên cứu của chúng tôi chứng minh trục CXCL5-neuronal CXCR2-TRPA1 góp phần gây đau viêm khớp do gút, dòng bạch cầu trung tính và viêm giúp mở rộng kiến thức của chúng ta về khả năng điều hòa miễn dịch của các tế bào thần kinh cảm giác về đêm.

Giới thiệu

Viêm khớp do gút là bệnh viêm khớp phổ biến nhất trên toàn thế giới^1,2. Nó được kích hoạt bởi sự lắng đọng tinh thể urat monosodium (MSU) trong các khớp¹. Bệnh nhân bị viêm khớp gút bị sưng khớp và bị đau dữ dội ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động hàng ngày và chất lượng cuộc sống^3,4. Thật không may, tỷ lệ mắc bệnh viêm khớp gút không ngừng tăng do dân số già, béo phì và thay đổi chế độ ăn uống. Để kiểm soát các cơn gút cấp tính, bệnh nhân được kê đơn colchicine, thuốc chống viêm không steroid hoặc corticosteroid¹. Tuy nhiên, việc sử dụng liên tục các loại thuốc này dẫn đến tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là ở những bệnh nhân mắc các bệnh đi kèm như bệnh thận mãn tính hoặc tiểu đường, hạn chế sử dụng thường xuyên^3,5,6. Kháng thể trung hòa IL-1β hoặc thuốc đối kháng IL-1R là những lựa chọn mới, tuy nhiên bệnh nhân vẫn cần được theo dõi chặt chẽ về khả năng không dung nạp và tác dụng phụ^7,8. Do đó, việc xác định một mục tiêu điều trị mới cho viêm khớp do gút có ý nghĩa lâm sàng rất lớn.

Sự lắng đọng MSU trong khớp kích hoạt miễn dịch. Các đại thực bào cư trú mô nhấn chìm MSU thông qua thực bào và giải phóng một bảng cytokine hoặc chemokine (ví dụ: IL-1β, TNF-α)^9,10,11. Những cytokine hoặc chemokine này thúc đẩy việc tuyển dụng bạch cầu trung tính trong khớp, đó là dấu hiệu của viêm khớp gút cấp tính^12,13. Dòng bạch cầu trung tính vào khớp có thể giải phóng ROS và các chất trung gian gây viêm góp phần gây đau và tổn thương mô^12,14,15. Tuy nhiên, cơ chế cơ bản về cách tín hiệu đau được tạo ra ở các khớp bị viêm trong bối cảnh viêm khớp do gút vẫn chưa được hiểu đầy đủ.

Chemokine CXCL5 thuộc họ chemokine CXC. Nó là một chất trung gian gây viêm và một chất hấp dẫn hóa học bạch cầu trung tính mạnh mẽ¹⁶. Nó chủ yếu hoạt động thông qua CXCR2 để tạo ra các hiệu ứng sinh học, mặc dù nó cũng có hoạt tính yếu trên CXCR1^17,18. CXCL5 được chứng minh là góp phần gây đau do cháy nắng bằng cách tuyển dụng thâm nhiễm tế bào viêm¹⁹. CXCR2 biểu hiện nhiều trên bạch cầu trung tính và rất quan trọng đối với hóa trị bạch cầu trung tính²⁰. Ngoài hệ thống miễn dịch, biểu hiện CXCR2 cũng được tìm thấy trong các tế bào thần kinh cảm giác ngoại biên và tủy sống, có thể góp phần vào cơ chế đau^21,22.

Ở đây, chúng tôi xác định rằng CXCL5 là một trong những chemokine hàng đầu biểu hiện quá mức trong khớp mắt cá chân của mô hình viêm khớp bệnh gút chuột. Nó hoạt động dựa trên CXCR2 trong các tế bào thần kinh nociceptor để kích hoạt TRPA1, dẫn đến khử cực màng và hyperexcitability. Bằng cách sử dụng xóa Cxcr2 đặc hiệu cho tế bào thần kinh cảm giác, chúng tôi đã tìm thấy CXCR2 thần kinh làm trung gian đau do CXCL5 và viêm thần kinh. CXCR2 thần kinh phối hợp với CXCR2 bạch cầu trung tính để góp phần vào hóa trị bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra bằng cách thúc đẩy giải phóng peptide liên quan đến gen calcitonin (CGRP) và giải phóng chất P (SP) và thoát mạch huyết tương. Xóa Cxcr2 đặc hiệu tế bào thần kinh giúp cải thiện đau khớp, thâm nhiễm bạch cầu trung tính và suy giảm dáng đi ở chuột mô hình. CXCR2 được biểu hiện trong tế bào thần kinh hạch rễ lưng người (DRG) và CXCL5 tăng trong huyết thanh từ bệnh nhân viêm khớp do gút và tương quan tích cực với nồng độ urat huyết thanh. Phát hiện của chúng tôi chứng minh rằng CXCL5 kích hoạt CXCR2 trong tế bào thần kinh nociceptor để thúc đẩy bệnh gút cấp tính, viêm khớp, đau và viêm khớp. Nhắm mục tiêu CXCR2 trong các tế bào thần kinh nociceptor bẩm sinh khớp có thể là một liệu pháp tiềm năng cho viêm khớp do gút.

Kết quả

CXCL5 tăng cao ở khớp mắt cá chân bị viêm của chuột mô hình viêm khớp do gút và góp phần gây đau khớp và viêm

Chúng tôi đã thiết lập một mô hình chuột bị viêm khớp do gút bằng cách tiêm MSU vào khớp mắt cá chân như mô tả^23,24. Chuột kiểm soát được tiêm PBS. Chuột mô hình cho thấy sự gia tăng rõ ràng về đường kính mắt cá chân và dị ứng cơ học so với chuột đối chứng (Hình. 1A–C). Để tìm kiếm các con đường tín hiệu có thể góp phần gây đau viêm khớp do gút và viêm khớp, chúng tôi đã thực hiện lập hồ sơ biểu hiện gen ở khớp mắt cá chân thông qua giải trình tự RNA (RNA-Seq). Các mẫu được thu thập vào thời điểm 8 và 24 giờ khi chuột mô hình bị đau và viêm dữ dội. RNA-Seq đã xác định được một số gen biểu hiện khác biệt (DEG) tại các điểm hai thời điểm này (Hình bổ sung. 1). Chúng tôi đã vượt qua hai bộ dữ liệu này để có được một bộ DEG cốt lõi được thay đổi đồng thời từ 8 đến 24 giờ (Hình. 1Đ).

Hình ảnh đại diện cho thấy khớp mắt cá chân được tiêm PBS (nhóm đối chứng) hoặc MSU (nhóm MSU). Các hình ảnh được chụp 24 giờ sau khi tiêm bằng cách sử dụng máy ảnh. B Delta thay đổi đường kính mắt cá chân của đối chứng và MSU nhóm chuột trong khóa học thời gian. C 50% PWT thay đổi kiểm soát và nhóm chuột MSU trong khóa học thời gian. Sơ đồ D Venn minh họa các DEG chồng chéo được xác định từ các điểm thời gian 8 và 24 giờ. Bộ dữ liệu của các điểm thời gian 24 giờ được lấy từ nghiên cứu gần đây của chúng tôi¹⁴ và phân tích lại cho phù hợp. Phân tích E KEGG về các DEG chồng chéo được xác định trong bảng điều khiển (E). F Danh sách các gen xếp hạng hàng đầu bao gồm trong tương tác thụ thể cytokine-cytokine như trong bảng (E). Những thay đổi nếp gấp tuyệt đối của các gen này được hiển thị. Xét nghiệm G qPCR biểu hiện gen Cxcl5 trong đối chứng và nhóm MSU 24 h. Xét nghiệm H CXCL5 ELISA của mô khớp mắt cá chân homogenates từ đối chứng và 8, 24, 48 h sau khi tiêm MSU **p < 0,01, *p < 0,05 so với đối chứng. I Tác dụng của kháng thể trung hòa CXCL1, CXCL2 hoặc CXCL5 (3 μg / 5 μl) hoặc IgG kiểm soát isotype trên dị ứng cơ học của chuột mô hình. J Tác dụng của kháng thể trung hòa hoặc isotype kiểm soát IgG trên đường kính mắt cá chân của chuột mô hình. **p < 0,01, *p < 0,05 so với nhóm MSU + Iso IgG. ANOVA hai chiều (các biện pháp lặp đi lặp lại) với thử nghiệm sau hoc của Bonferroni đã được sử dụng (bảng B, C, I và J). ANOVA một chiều với thử nghiệm sau hoc của Bonferroni đã được sử dụng cho bảng điều khiển (H). Bài kiểm tra t không ghép đôi của học sinh (hai đuôi) được sử dụng cho bảng (G). Data được hiển thị là trung bình ± SEM. Số n, giá trị p chính xác và kết quả thống kê được cung cấp trong tệp Dữ liệu nguồn.

Phân tích tin sinh học của bộ DEG cốt lõi này đã xác định một số con đường tín hiệu phong phú, trong đó tương tác thụ thể cytokine-cytokine được xếp hạng hàng đầu (Hình. 1E). Tương tác thụ thể cytokine-cytokin đóng một vai trò quan trọng trong việc trung gian đau và viêm²⁵. Chúng tôi đã kiểm tra danh sách đầy đủ các DEG trong đường dẫn này (Hình. 1F). Quan tâm đặc biệt là chemokine CXCL5, một trong những gen được điều hòa hàng đầu. CXCL5 trước đây không liên quan đến đau gút nhưng đã được chứng minh là có liên quan đến đau cháy nắng¹⁹. qPCR xác nhận sự điều hòa gen Cxcl5 ở khớp mắt cá chân của chuột mô hình (Hình. 1G). ELISA cho thấy biểu hiện CXCL5 tăng lên ở khớp mắt cá chân của chuột mô hình 8, 24 và 48 giờ sau khi thiết lập mô hình (Hình. 1H). Sau đó, chúng tôi khám phá nguồn tế bào của CXCL5. CXCL5 có thể được sản xuất bởi các đại thực bào, tế bào mast, nguyên bào sợi, v.v.^26,27,28. và các tế bào này có thể được kích hoạt bởi MSU^14,29,30. Nhuộm miễn dịch khớp mắt cá chân từ chuột mô hình bệnh gút cho thấy phần lớn (56,6%) tế bào CXCL5 đồng nhuộm bằng vimentin đánh dấu tế bào nguyên bào sợi và ở mức độ thấp hơn, đồng nhuộm bằng các dấu hiệu cho đại thực bào (Iba-1) và tế bào mast (avidin) (lần lượt là 30,0% và 12,3%) (Hình bổ sung. 2). Kết quả này cho thấy CXCL5 có thể được sản xuất từ một số loại tế bào trong khớp bị viêm, bao gồm nguyên bào sợi, đại thực bào và tế bào mast, trong viêm khớp do bệnh gút.⁺

Các kháng thể trung hòa chống lại CXCL5, CXCL2 hoặc CXCL1 hoặc IgG kiểm soát isotype được tiêm (3 μg / vị trí) vào khớp mắt cá chân. Trung hòa CXCL5 làm suy giảm đáng kể allodynia cơ học và đường kính mắt cá chân của chuột mô hình so với IgG đối chứng (Hình. 1I và J). Tuy nhiên, trung hòa CXCL1 hoặc CXCL2 chỉ cho thấy tác dụng cải thiện đường kính khớp mắt cá chân chứ không cho thấy đau (Hình. 1I và J). Kháng thể trung hòa CXCL5 làm giảm đáng kể thâm nhiễm bạch cầu trung tính và đại thực bào ở khớp mắt cá chân của chuột mẫu bệnh gút, được chỉ định bằng xét nghiệm nhuộm miễn dịch và myeloperoxidase (MPO) (Hình bổ sung. 3A–E). Những kết quả này cho thấy chemokine CXCL5 góp phần gây đau và viêm khớp ở chuột mẫu bệnh gút.

Thụ thể CXCL5 CXCR2 được biểu hiện trong các tế bào thần kinh DRG bẩm sinh khớp mắt cá chân chuột

Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng tăng CXCL5 ở khớp mắt cá chân của chuột mô hình bệnh gút có thể tác động lên các thụ thể của nó biểu hiện trên các tế bào thần kinh cảm giác ngoại biên để tạo ra cơn đau. Chúng tôi đã kiểm tra sự biểu hiện của gen Cxcr1 và Cxcr2 trong DRG chuột. PCR từ chuột DRG chỉ phát hiện Cxcr2 chứ không phát hiện biểu hiện Cxcr1. Để kiểm soát tích cực, cả hai gen đều được phát hiện trong lá lách chuột (Hình. 2A). Kết quả này loại trừ biểu hiện Cxcr1 trong tế bào thần kinh DRG. Các nghiên cứu trước đây đã ghi nhận biểu hiện CXCR2 trong tế bào thần kinh DRG^22,31. Chúng tôi đã kiểm tra thêm xem CXCR2 có được biểu hiện trong các tế bào thần kinh DRG bẩm sinh khớp mắt cá chân được dán nhãn bằng cách tiêm WGA đánh dấu ngược dòng trước đó vào khớp mắt cá chân hay không³². Các tế bào thần kinh được dán nhãn WGA (WGA) chiếm 28,9% tổng số tế bào thần kinh DRG (NeuN). CXCR2 được biểu hiện trong 92,7% tế bào thần kinh NeuN và trong 97,3% tế bào thần kinh DRG bẩm sinh khớp mắt cá chân được dán nhãn WGA (Hình. 2B và C). CXCR2 được biểu hiện độc quyền với dấu hiệu tế bào thần kinh NeuN nhưng hầu như không có dấu hiệu tế bào thần kinh đệm vệ tinh GFAP (Hình. 2B, C và E). Tính đặc hiệu của kháng thể CXCR2 đã được xác nhận khi không có nhuộm miễn dịch trong DRG từ Cxcr2⁺⁺⁺^−/− chuột (Hình. 2D). Chúng tôi đã lập bản đồ hồ sơ biểu hiện CXCR2 trong các tế bào thần kinh DRG bẩm sinh khớp mắt cá chân với kháng thể đặc hiệu này và đồng nhuộm với các dấu hiệu cho các quần thể tế bào khác nhau. Hình 2F cho thấy CGRP, IB4 và NF200 được biểu hiện lần lượt ở 51,6%, 30,1% và 27,6% tế bào CXCR2WGA. Những dữ liệu này đã chứng minh rằng các tế bào thần kinh cảm giác bẩm sinh khớp mắt cá chân, bao gồm các tế bào thần kinh cảm giác về đêm, có biểu hiện CXCR2, cung cấp cơ sở phân tử có thể cho sự tương tác của CXCL5 với CXCR2 thần kinh trong bối cảnh viêm khớp do gút.⁺⁺

**Hình 2: CXCR2 được thể hiện ở các tế bào thần kinh cảm giác chuột bẩm sinh khớp mắt cá chân.**

CXCL5 / CXCR2 báo hiệu chức năng cặp với kênh TRPA1 trong tế bào thần kinh DRG của chuột

Sự tiếp xúc của các tế bào thần kinh DRG nuôi cấy với CXCL5 (rmCXCL5, 100 nM) của chuột đã kích hoạt Ca rõ ràng²⁺ quá độ trong một nhóm nhỏ các tế bào thần kinh DRG, chiếm 26,0% trong số tất cả các quần thể tế bào thần kinh (Hình. 3A – C và F). 79,3% tế bào thần kinh đáp ứng CXCL5 (CXCL5) cho thấy đáp ứng với allyl isothiocyanate (AITC, 100 μM, chất chủ vận TRPA1), trong khi 69,7% tế bào thần kinh CXCL5 cho thấy phản ứng với ứng dụng capsaicin (chất chủ vận TRPV1, 300 nM) (Hình. 3B và C). Độ lớn của Ca⁺⁺²⁺ phản ứng gây ra bởi CXCL5 có tương quan nghịch với kích thước tế bào thần kinh; cụ thể, phản ứng mạnh hơn thường được ghi nhận từ các tế bào thần kinh nhỏ đến trung bình (Hình. 3D). Những dữ liệu này cho thấy các tế bào thần kinh đáp ứng CXCL5 chủ yếu là các tế bào thần kinh cảm giác về đêm. CA kích hoạt phụ thuộc liều CXCL5²⁺ đáp ứng trong tế bào thần kinh DRG của chuột (EC₅₀ = 24,8 ± 1,9 nM) (Hình. 3E). Tiếp theo, chúng tôi so sánh tác dụng của CXCL5 với các chemokine khác nhắm mục tiêu tương tự CXCR2, bao gồm CXCL1 và CXCL2. Khi thử nghiệm ở cùng một liều lượng (100 nM), CXCL1 và CXCL5 đều tạo ra Ca²⁺ đáp ứng trong tế bào thần kinh DRG của chuột. Phản ứng của CXCL5 cao hơn đáng kể so với CXCL1, trong khi CXCL2 không có tác dụng (Hình. Tầng 3).

**Hình 3: CXCL5 tác động lên CXCR2 để kích hoạt TRPA1 trong tế bào thần kinh DRG của chuột.**

Tác dụng của CXCL5 đã giảm đáng kể khi nó bị biến tính bằng cách đun sôi hoặc tiền xử lý bằng chất đối kháng đặc hiệu CXCR2 SB225002 (100 nM) hoặc trong các tế bào thần kinh có nguồn gốc từ Cxcr2^−/− chuột (Hình. 3G, bảng điều khiển bên trái), cho thấy CXCR2 là thụ thể chính cho CXCL5 trong tế bào thần kinh DRG. Kết quả tương tự cũng thu được từ các tế bào thần kinh bị thách thức CXCL1 (Hình. 3G, bảng điều khiển bên phải). Vì CXCL5 tạo ra Ca cao hơn đáng kể²⁺ đáp ứng hơn CXCL1 và góp phần đáng kể vào đau viêm khớp do bệnh gút, do đó chúng tôi đặc biệt tập trung vào CXCL5 trong các nghiên cứu sau đây của chúng tôi. Thay thế dung dịch ngoại bào (ES) bằng Ca²⁺-free ES (Hình. 3H) hoặc xử lý các tế bào bằng thuốc chẹn kênh TRP phổ rộng ruthenium đỏ (RR, 10 μM, Hình. 3I) phần lớn loại bỏ capsaicin-, AITC- và CXCL5-gây ra Ca²⁺ phản hồi, gợi ý các kênh TRP là mục tiêu xuôi dòng có thể của tín hiệu CXCL5 / CXCR2 trong tế bào thần kinh DRG của chuột. Chúng tôi lý luận rằng CXCL5 / CXCR2 có thể kết hợp với TRPV1 hoặc TRPA1. Sau đó, chúng tôi đã kiểm tra giả thuyết này bằng cách xử lý các tế bào có AMG9810 (1 μM) hoặc HC030031 (100 μM) để chặn cụ thể TRPV1 hoặc TRPA1. Ca do CXCL5 gây ra²⁺ đáp ứng đã giảm đáng kể bởi HC030031 nhưng không phải bởi AMG9810 (Hình. 3J). Tiếp theo chúng tôi đã thử nghiệm tác dụng của CXCL5 đối với các tế bào thần kinh DRG có nguồn gốc từ Trpv1^−/− và Trpa1^−/− Chuột. Ca do CXCL5 gây ra²⁺ phản ứng gần như bị bãi bỏ hoàn toàn trong các tế bào thần kinh có nguồn gốc từ Trpa1^−/− nhưng không phải từ Trpv1^−/− chuột (Hình. 3K và L). Capsaicin- hoặc Ca do AITC gây ra²⁺ phản ứng đã bị bãi bỏ trong Trpv1^−/− và Trpa1^−/− chuột, tương ứng, chứng minh tính hợp lệ của các chủng chuột loại trực tiếp (Hình. 3K và L). Chúng tôi đã khám phá xem CXCR2 có hiển thị đồng bản địa hóa không gian với TRPA1 hay không. RNAscope kết hợp với miễn dịch huỳnh quang cho thấy gen Trpa1 được biểu hiện trong 44,2% tế bào thần kinh nhuộm màu dương CXCR2 (CXCR2) ở chuột DRG, cung cấp hỗ trợ giải phẫu mạnh mẽ cho khớp nối CXCR2 và TRPA1 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm (Hình. 3 triệu).⁺

Khám phá cơ sở sinh hóa làm cơ sở cho hoạt hóa TRPA1 qua trung gian CXCR2

Sau đó, chúng tôi đã hỏi liệu tín hiệu CXCL5-CXCR2-TRPA1 được xác định từ các tế bào thần kinh DRG của chuột có thể được tái tạo trong một hệ thống biểu hiện dị thể hay không. Ứng dụng của rmCXCL5 (100 nM) không gợi lên bất kỳ Ca nào²⁺ đáp ứng trong HEK293T tế bào được truyền plasmid chứa vectơ rỗng, mCxcr2 (chuột Cxcr2) hoặc mTrpa1 một mình hoặc mCxcr1 + mTrpa1 (Hình. 4A – F). Ngược lại, HEK293T tế bào được truyền mCxcr2 + mTrpa1 cho thấy Ca mạnh mẽ²⁺ phản hồi khi áp dụng CXCL5 (Hình. 4A-F, E và F), cho thấy cả CXCR2 và TRPA1 đều cần thiết để tạo ra tác dụng của CXCL5 đối với các tế bào HEK293T.

**Hình 4: Cơ sở sinh hóa làm cơ sở kích hoạt TRPA1 qua trung gian CXCR2.**

Nghiên cứu trước đây cho thấy Gβγ có thể đóng vai trò là tín hiệu xuôi dòng của GPCR để kích hoạt TRPA1^33,34. Nhưng chính xác Gβγ hoạt động như thế nào để kích hoạt TRPA1 vẫn chưa được biết. Chúng tôi đã sử dụng hệ thống biểu thức để kiểm tra xem việc cô lập các tiểu đơn vị Gβγ nội sinh có thể chặn kích hoạt mTRPA1 bằng mCXCR2 hay không. Truyền HEK293T tế bào bằng Gαtransducin (Gαt) hoặc miền đầu cuối carboxy của thụ thể kết hợp protein G kinase 2 (GRK2ct), cả hai đều là những người nhặt rác của tiểu đơn vị Gβγ^35,36,37, giảm đáng kể kích hoạt mTRPA1 bởi mCXCR2 khi thử thách CXCL5 (Hình. 4G). Chúng tôi tiếp tục sử dụng siRNA để hạ gục các đồng phân Gβ biểu hiện nhiều nhất, Gβ1 và Gβ2, trong các tế bào HEK293T³⁸. Loại bỏ gen Gnb1 và Gnb2 làm giảm đáng kể kích hoạt mTRPA1 bởi mCXCR2 khi thử thách CXCL5 (Hình. 4G). AITC kích hoạt TRPA1 thông qua sửa đổi cộng hóa trị trực tiếp dư lượng cysteine trong kênh TRPA1³⁹. Chúng tôi thấy rằng cả việc cô lập Gβγ nội sinh cũng như hạ gục biểu hiện Gnb1 và Gnb2 đều không có bất kỳ ảnh hưởng đáng kể nào đến việc kích hoạt TRPA1 do AITC gây ra (Hình. 4H). Những kết quả này chỉ ra rằng CXCR2 kích hoạt TRPA1 thông qua tín hiệu Gβγ.

Sau khi phân ly khỏi Gα khi kích hoạt, Gβγ có thể điều chỉnh hoạt động của kênh ion thông qua liên kết trực tiếp với kênh hoặc thông qua kích hoạt tín hiệu xuôi dòng^40,41. Chúng tôi đã kiểm tra xem tín hiệu xuôi dòng liên quan đến Gβγ có góp phần kích hoạt TRPA1 bằng CXCR2 hay không. Ngăn chặn dược lý tín hiệu hạ lưu liên quan đến Gβγ, bao gồm phospholipase C (PLC), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), protein kinase A (PKA) hoặc protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) ở liều lượng hiệu quả không ảnh hưởng đáng kể đến việc kích hoạt mTRPA1 bởi mCXCR2 khi thử thách CXCL5. Tương tự, việc chặn các con đường này không ảnh hưởng đến kích hoạt TRPA1 do AITC gây ra (Hình. 4H). Để khám phá thêm xem Gβγ có liên kết trực tiếp với TRPA1 khi kích hoạt CXCR2 hay không, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm kết tủa đồng miễn dịch (Co-IP). Co-IP sử dụng kháng thể kháng TRPA1 cho thấy sự kết hợp mạnh hơn của Gβ với TRPA1 khi kích hoạt CXCR2 bởi CXCL5. (Hình. 4I và J). Những kết quả này cho thấy Gβγ có thể liên kết với TRPA1 khi kích hoạt CXCR2.

Để khám phá thêm cơ sở cấu trúc của quy định CXCR2 của TRPA1, chúng tôi đã thực hiện mô hình dựa trên cấu trúc để dự đoán liên kết mTRPA1 và Gβγ. Mô hình lắp ghép cho thấy Gβ liên kết với miền cấu trúc nội bào của mTRPA1, với K992-M1018 trong mTRPA1 là vùng tương tác trực tiếp và cấu trúc thứ cấp của vùng này cho thấy một chuỗi xoắn và tấm β (Hình. 4K–N). Khu vực chúng tôi dự đoán nơi mTRPA1 liên kết với Gβ nằm ở đầu C của chuỗi xoắn TRP và Gβ liên kết với TRPA1 ở vị trí tương tự về mặt không gian như TRPM3, cả hai đều nằm ở phía dưới của miền cấu trúc xuyên màng và ở phần lớn nhất của bán kính protein như đã báo cáo gần đây⁴². Phân tích tương tác tĩnh điện cho thấy phân khúc K992-M1018 của mTRPA1 thể hiện tính năng tiềm năng cao, bổ sung hoàn hảo cho tiềm năng thấp của vùng tương tác Gβ (Hình. 4N, vùng A và B). Như thể hiện trong Hình. 4O, chúng tôi đã xác định được năm dư lượng chính liên quan đến tương tác tĩnh điện của mTRPA1 với Gβ, bao gồm R1012 / R1017 ở vùng A và R999 / K1000 / R1004 ở vùng B. Tương tự như mô hình làm việc cho phức hợp TRPM3-Gβγ, K992-M1018 của TRPA1 không tương tác với Gγ ở xa không gian⁴².

Sau đó, chúng tôi đã thực hiện các đột biến điểm của các phần còn lại quan trọng này để xem liệu chúng có ảnh hưởng đến liên kết Gβ với mTRPA1 và sau đó ảnh hưởng đến kích hoạt mTRPA1 bởi mCXCR2 hay không. Đột biến của hai dư lượng (R1012 và R1017) nằm ở vùng A chỉ làm giảm nhẹ kích hoạt TRPA1. Đột biến của ba dư lượng (R999, K1000 và R1004) nằm ở vùng B làm giảm đáng kể kích hoạt mTRPA1 do mCXCR2 gây ra. Hơn nữa, đột biến của cả năm dư lượng gây ra sự giảm kích hoạt mTRPA1 rõ ràng nhất bởi mCXCR2 (Hình. 4P). Chúng tôi đã xác định trước rằng tất cả các protein kênh mang các đột biến điểm này vẫn còn hoạt động vì AITC gợi lên các phản ứng tương tự trong kiểu hoang dã và tất cả các kênh đột biến (Hình. 4P). Cuối cùng, chúng tôi đã kiểm tra xem kênh TRPA1 bị đột biến có biểu hiện giảm liên kết với Gβ bằng đồng IP hay không. Sự liên kết của TRPA1 với Gβ đã giảm rõ rệt do đột biến của cả 5 dư lượng (Hình. 4Q). Dựa trên những kết quả này, chúng tôi suy đoán rằng Gβγ liên kết với đoạn K992-M1018 của TRPA1 gây ra chuyển động ra ngoài của chuỗi xoắn TRP, kéo TM6 trải qua di căn và mở cửa dưới của kênh TRPA1 (Hình. 4R). Do đó, chúng tôi đã xác định các vùng chính và dư lượng nằm trong TRPA1 có liên quan đến liên kết với Gβγ, dẫn đến kích hoạt kênh tiếp theo.

CXCL5 khử cực và kích thích các tế bào thần kinh DRG về đêm thông qua cơ chế phụ thuộc CXCR2 và TRPA1

Chúng tôi đã thử nghiệm tác dụng của CXCL5 đối với tính dễ bị kích thích của tế bào thần kinh DRG chuột. Chúng tôi đã chọn DRG kích thước nhỏ (Cm < 42 pF) để ghi lại như trong nghiên cứu gần đây của chúng tôi vì phần lớn các tế bào thần kinh này là về đêm^43,44. Ứng dụng tắm của rmCXCL5 (100 nM) làm tăng đáng kể tiềm năng hành động (AP) bắn được kích hoạt bằng cách tiêm một bước dòng điện trong tế bào thần kinh DRG so với tế bào thần kinh được điều trị bằng xe (Hình. 5A và B). Hình 5C – F cho thấy các AP được gợi lên bởi dòng phun 150 pA khi một tế bào thần kinh được xử lý bằng xe hoặc CXCL5. Một số thông số của điện sinh lý được liệt kê trong Bảng bổ sung 2. Sự gia tăng bắn AP do CXCL5 gây ra đã giảm đáng kể bằng cách sử dụng chất đối kháng đặc hiệu CXCR2 SB225002 (100 nM) hoặc chất đối kháng đặc hiệu TRPA1 HC030031 (100 μM) (Hình. 5G–J). Sự gia tăng do CXCL5 gây ra trong việc bắn AP cũng giảm trong các tế bào thần kinh DRG có nguồn gốc từ Cxcr2^−/− hoặc Trpa1^−/− chuột (Hình. 5K–N). CXCL5 đã kích hoạt sự khử cực rõ ràng của tiềm năng màng nghỉ ngơi trong các tế bào thần kinh DRG có kích thước nhỏ (Hình. 5O). Ngăn chặn dược lý CXCR2 hoặc TRPA1 hoặc xóa di truyền Cxcr2 hoặc Trpa1 đều làm suy yếu đáng kể khả năng khử cực màng kích hoạt CXCL5 (Hình. 5O). Do đó, CXCL5 khử cực và kích thích các tế bào thần kinh DRG của chuột thông qua các cơ chế phụ thuộc CXCR2 và TRPA1.

**Hình 5: CXCL5 khử cực và kích thích các tế bào thần kinh DRG sống về đêm của chuột thông qua cơ chế phụ thuộc CXCR2 và TRPA1.**

CXCR2 biểu hiện trong các tế bào thần kinh DRG về đêm góp phần gây đau cơ học và viêm khớp do CXCL5 gây ra

CXCL5 đã được báo cáo là gây đau cơ học, quá mẫn cảm và thâm nhiễm tế bào viêm ở chuột ngây thơ¹⁹. Nhưng tín hiệu hạ lưu của nó vẫn chưa được biết đến. Chúng tôi đã kiểm tra xem CXCR2 có chịu trách nhiệm cho những hiệu ứng này bởi CXCL5 hay không. Tiêm CXCL5 nội nhãn (3–300 ng / mắt cá chân) tạo ra dị ứng cơ học và tăng đường kính khớp theo cách phụ thuộc vào liều ở chuột (Hình bổ sung. 4A và B). Vì 300 ng CXCL5 tạo ra hiệu quả rõ ràng nhất, chúng tôi đã chọn liều lượng này cho các nghiên cứu tiếp theo. Chứng dị ứng cơ học do CXCL5 gây ra gần như suy yếu hoàn toàn do tắc nghẽn dược lý của CXCR2 (Hình bổ sung. 4C). Hơn nữa, Cxcr2^−/− chuột có biểu hiện giảm đáng kể dị ứng cơ học và đường kính khớp so với chuột WT khi tiêm CXCL5 (Hình bổ sung. 4D và E).

Để hiểu rõ hơn về sự đóng góp của CXCR2 thần kinh đối với đau và viêm cơ học do CXCL5 gây ra, chúng tôi đã tạo ra một dòng chuột mới với việc xóa Cxcr2 có điều kiện trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm ngoại vi biểu hiện Nav1.8 bằng SNS-Cre^45,46 (Hình. 6A). Nhuộm miễn dịch xác nhận giảm CXCR2 đặc biệt ở tế bào thần kinh DRG nhưng không phải ở lá lách, bạch cầu trung tính máu ngoại vi hoặc tủy sống của SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột (Hình. 6B–D, Hình bổ sung. 5A–D). SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột cho thấy tỷ lệ phần trăm bình thường của các quần thể tế bào thần kinh khác nhau trong DRG và bảo tồn ngoại vi và trung tâm bình thường (Hình bổ sung. 6A–H) và không có dấu hiệu bất thường về cân nặng, ngưỡng đau cơ bản đối với kích thích cơ học hoặc nhiệt và hoạt động vận động (Hình bổ sung. 6I–L). Những kết quả này cho thấy loại bỏ có điều kiện Cxcr2 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm là thành công.

**Hình 6: CXCR2 biểu hiện trong các tế bào thần kinh DRG về đêm góp phần gây ra chứng dị ứng cơ học do CXCL5 gây ra và viêm khớp ở chuột.**

Sau đó, chúng tôi đã kiểm tra xem CXCR2 trong các tế bào thần kinh về đêm có góp phần gây ra chứng dị ứng cơ học và viêm khớp do CXCL5 gây ra hay không. Chứng dị ứng cơ học do CXCL5 gây ra, viêm khớp và tăng biểu hiện gen tiền viêm (ví dụ: Il1b, Tnfa và Il6) đã giảm rõ rệt ở SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột so với kiểm soát âm SNS-Cre (Cxcr2^{fl / fl}) (Hình. 6F–K). Chúng tôi tiếp tục kiểm tra xem TRPA1 có cần thiết cho các tác dụng do CXCL5 gây ra hay không. So với các điều khiển WT, allodynia cơ học do CXCL5 gây ra đã được cải thiện đáng kể trong Trpa1^−/− nhưng không có trong Trpv1^−/− chuột (Hình bổ sung. 7A). Viêm khớp do CXCL5 và thâm nhiễm bạch cầu trung tính đã giảm đáng kể ở Trpa1^−/− chuột (Hình bổ sung. 7B và C). Những kết quả này chứng minh tín hiệu CXCR2-TRPA1 của tế bào thần kinh trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm góp phần gây đau cơ học và viêm khớp do CXCL5 gây ra.

CXCR2 tế bào thần kinh góp phần gây viêm thần kinh do CXCL5 và hóa trị bạch cầu trung tính

Vì CXCL5 tác động lên CXCR2 thần kinh để kích hoạt TRPA1, một kênh ion liên quan đến việc trung gian viêm thần kinh, sau đó chúng tôi đã kiểm tra xem CXCL5 có thể gây viêm thần kinh hay không. CXCL5 trong thực vật (300 ng/vị trí) gây viêm thần kinh rõ ràng ở Cxcr2^{fl / fl} chuột 3 giờ sau khi tiêm, như thể hiện bằng sự gia tăng đáng kể sự thoát mạch Evans blue (EB) ở bàn chân sau được tiêm. Thoát mạch EB do CXCL5 gây ra đã giảm đáng kể ở SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột hoặc Trpa1^−/− chuột hoặc ở chuột được điều trị bằng chất đối kháng thụ thể CGRP BIBN (60 ng / vị trí, i.pl.) hoặc chất đối kháng thụ thể SP NK-1 L-733060 (1 μg / vị trí, i.pl.) (Hình. 7A–C). Kể từ khi chúng tôi tìm thấy CXCR2 phần lớn đồng biểu hiện với các tế bào thần kinh CGRP DRG bằng cách nhuộm miễn dịch (Hình. 2F), chúng tôi đã kiểm tra xem CXCL5 có thể kích hoạt giải phóng CGRP và SP hay không, hai neuropeptide liên quan đến giãn mạch và thoát mạch huyết tương⁺⁴⁷, bằng cách kích hoạt CXCR2 tế bào thần kinh. CXCL5 trong cây (300 ng / vị trí) dẫn đến sự gia tăng rõ ràng nồng độ CGRP và SP ở bàn chân sau của Cxcr2^{fl / fl} chuột 3 giờ sau khi tiêm so với chuột được điều trị bằng xe (Hình. 7D và E), trong khi những mức tăng này đã giảm đáng kể trong SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột (Hình. 7D và E).

**Hình 7: CXCR2 thần kinh góp phần gây viêm thần kinh do CXCL5 và hóa trị bạch cầu trung tính ở chuột.**

CXCL5 tác động hóa trị mạnh lên bạch cầu trung tính bằng cách tác động lên CXCR2 bạch cầu trung tính⁴⁸. Vì chúng tôi thấy rằng CXCL5 hoạt động trên CXCR2 thần kinh để thúc đẩy thoát mạch huyết tương, nên rất hấp dẫn để biết liệu CXCR2 tế bào thần kinh có thể góp phần vào hóa trị bạch cầu trung tính của CXCL5 bằng cách thúc đẩy thoát mạch huyết tương hay không. Tiêm CXCL5 trong cây thúc đẩy tuyển dụng bạch cầu trung tính đáng kể ở bàn chân sau được tiêm Cxcr2^{fl / fl} chuột, như được tiết lộ bởi cả xét nghiệm MPO và nhuộm miễn dịch (Hình. 7F, Hình bổ sung. 7E và F). Việc tuyển dụng bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra đã giảm đáng kể ở SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} (Hình. 7F, Hình bổ sung. 7E, F). Tiêm CXCL5 vào chân sau không ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ CXCL5 trong huyết thanh ở cả Cxcr2^{fl / fl} hoặc SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột, loại trừ khả năng SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} có thể làm thay đổi gradient CXCL5 mô máu sau khi tiêm CXCL5 (Hình bổ sung. 7G). Những kết quả này cho thấy sự đóng góp quan trọng của CXCR2 tế bào thần kinh đối với hóa trị bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra.

Để hình dung trực tiếp bạch cầu trung tính, chúng tôi đã tạo ra một dòng chuột gõ Ly6G-GFP bằng kỹ thuật RNA hướng dẫn liên quan đến Cas9. Dòng chuột này mang GFP trong alen Ly6G (dấu hiệu bạch cầu trung tính), cho phép hình dung bạch cầu trung tính bằng huỳnh quang của nó. Tiêm CXCL5 trong thực vật đã kích hoạt sự di chuyển bạch cầu trung tính đáng chú ý đến chân sau được tiêm, như được tiết lộ bởi sự tích tụ tế bào Ly6g-GFP quá mức. Đối kháng dược lý thụ thể CGRP hoặc thụ thể SP NK-1 làm giảm đáng kể việc tuyển dụng bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra (Hình. 7G và H). Quan sát này đã được định lượng và xác nhận thêm bằng xét nghiệm MPO (Hình. 7I). Cuối cùng, chúng tôi đã kiểm tra xem CXCL5 có thể kích hoạt giải phóng CGRP và SP trong nuôi cấy tế bào thần kinh DRG trong ống nghiệm hay không (Hình. 7J). CXCL5 (30 nM) hoặc K cao (40 mM) dẫn đến giải phóng đáng kể CGRP và SP trong môi trường nuôi. Ngăn chặn dược lý CXCR2 hoặc TRPA1 làm giảm đáng kể sự giải phóng CGRP và SP do CXCL5 gây ra trong môi trường nuôi cấy (Hình. 7K và L). Những kết quả này chỉ ra rằng CXCL5 gây đau bằng cách kích hoạt tín hiệu CXCR2-TRPA1 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm, từ đó thúc đẩy giải phóng CGRP và SP và thoát mạch huyết tương sau đó tạo điều kiện cho dòng bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra.⁺⁺

Biểu hiện CXCR2 thần kinh và khớp nối của nó với TRPA1 được tăng cường trong trường hợp viêm khớp do gút

Biểu hiện CXCR2 ở khớp mắt cá chân bẩm sinh L3-L5 DRG cùng bên được điều hòa đáng kể ở chuột mô hình viêm khớp do gút so với chuột đối chứng 8 và 24 giờ sau khi thiết lập mô hình (Hình. 8A). Nhuộm miễn dịch CXCR2 ở chuột mô hình L3-L5 DRG mạnh hơn ở chuột mô hình so với chuột đối chứng (Hình. 8B và C). Chúng tôi đã nghiên cứu khả năng ghép nối tiềm năng của CXCR2 với TRPA1 bằng Co-IP. Co-IP sử dụng kháng thể kháng CXCR2 cho thấy sự kết hợp của TRPA1 với CXCR2 trong DRG trong điều kiện kiểm soát. Khớp nối đã được tăng cường trong DRG từ chuột mô hình viêm khớp bệnh gút (Hình. 8D). Ngược lại, co-IP sử dụng kháng thể kháng TRPA1 đã xác định khớp nối tăng cường tương tự của CXCR2 với TRPA1 trong tình trạng viêm khớp do gút (Hình. 8E). Sau đó, chúng tôi nghiên cứu Ca do CXCL5 gây ra²⁺ phản ứng trong tế bào thần kinh DRG từ chuột mô hình kiểm soát và bệnh gút. Tỷ lệ tế bào thần kinh đáp ứng CXCL5 đã tăng đáng kể ở nhóm mô hình bệnh gút so với nhóm đối chứng (Hình. 8F và G). Những kết quả này đã chứng minh biểu hiện CXCR2 của tế bào thần kinh, khớp nối của nó với TRPA1 và chức năng của nó, tất cả đều tăng lên ở khớp mắt cá chân bẩm sinh tế bào thần kinh DRG trong tình trạng viêm khớp do bệnh gút.

**Hình 8: Biểu hiện CXCR2 và chức năng của nó trong tế bào thần kinh DRG của chuột được tăng cường trong tình trạng viêm khớp do gút.**

CXCR2 thần kinh góp phần gây đau viêm khớp do bệnh gút, viêm khớp và suy giảm dáng đi

Trong mô hình viêm khớp bệnh gút, cả nam và nữ SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột biểu hiện dị ứng cơ học được cải thiện đáng kể và tăng đường kính mắt cá chân ít hơn so với Cxcr2^{fl / fl} chuột (Hình. 9A và B, Hình bổ sung. 8A và B). Nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) cho thấy sự gia tăng đáng kể điểm mô bệnh học khớp mắt cá chân của Cxcr2^{fl / fl} chuột trong tình trạng viêm khớp do gút, đã suy yếu trong SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột (Hình bổ sung. 9A và B). Thâm nhiễm bạch cầu trung tính là dấu hiệu của viêm khớp gút cấp tính và góp phần gây đau cấp tính và viêm khớp⁴⁹. SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột cho thấy giảm đáng kể thâm nhiễm bạch cầu trung tính ở khớp mắt cá chân so với Cxcr2^{fl / fl} chuột trong tình trạng viêm khớp do gút, được tiết lộ bởi xét nghiệm MPO và tế bào học dòng chảy (Hình. 9C–G). Nồng độ CGRP và SP đều tăng đáng kể ở khớp mắt cá chân của Cxcr2^{fl / fl} chuột trong bối cảnh viêm khớp do gút nhưng giảm đáng kể ở SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột (Hình. 9H và tôi). Ức chế dược lý của thụ thể CGRP hoặc thụ thể SP NK-1 làm giảm đáng kể sự xâm nhập của bạch cầu trung tính cũng như đại thực bào trong các mô quanh khớp của chuột mô hình (Hình. 9J–L, Hình bổ sung. 10). Ngoài ra, MSU gây ra sự điều hòa của một loạt các cytokine trong khớp mắt cá chân của chuột kiểm soát âm tính SNS-Cre. SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột cho thấy biểu hiện giảm đáng kể của Il1b, Il6, Tnfa, Cxcl2, Cxcl1, Ccl2 và Ccl3 (Hình. 9M). Phân tích dáng đi cho thấy chuột mô hình cho thấy sự suy giảm dáng đi rõ ràng về tư thế, chiều dài sải chân và tỷ lệ diện tích bàn chân ở bàn chân sau 8 giờ sau khi thiết lập mô hình. Những khiếm khuyết này đã được đảo ngược trong SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột (Hình. 9N). Những phát hiện này cho thấy CXCR2 thần kinh góp phần gây đau viêm khớp do gút, viêm khớp và suy giảm dáng đi.

**Hình 9: CXCR2 thần kinh góp phần gây dị ứng cơ học, viêm khớp và suy giảm dáng đi ở chuột mô hình viêm khớp do gút.**

CXCR2 được biểu hiện trong tế bào thần kinh DRG ở người và CXCL5 tăng trong huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính

Để biết liệu những phát hiện của chúng tôi có thể có ý nghĩa tịnh tiến hay không, chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiện CXCR2 trong các mẫu DRG ở người. PCR cho thấy CXCR2, nhưng không phải gen CXCR1, được biểu hiện trong DRG ở người (Hình. 10A). Nhuộm miễn dịch cho thấy phần lớn các tế bào biểu hiện CXCR2 (>95%) được đồng nhuộm với NeuN, cho thấy CXCR2 chủ yếu được biểu hiện trong các tế bào thần kinh DRG của con người (Hình. 10B). Áp dụng CXCL5 tái tổ hợp của con người (rhCXCL5, 100 nM) kích hoạt mạnh mẽ Ca²⁺ thoáng qua trong HEK293T tế bào đồng truyền với cả TRPA1 của con người và CXCR2 của con người (Hình. 10C – G). Nhưng rhCXCL5 không hiệu quả trong các tế bào được truyền bằng vectơ rỗng hoặc TRPA1 của con người hoặc CXCR2 của con người (Hình. 10C – G). Chúng tôi đã lấy mẫu huyết thanh từ bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính và các đối chứng khỏe mạnh và nghiên cứu nồng độ CXCL5 trong huyết thanh (Bảng S3). Đúng như dự đoán, nồng độ axit uric huyết tương và IL-1β ở bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính cao hơn đáng kể so với nhóm chứng khỏe mạnh (Hình. 10H, Bảng S3). Hơn nữa, CXCL5 huyết thanh tăng đáng kể ở bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính so với nhóm chứng khỏe mạnh (Hình. 10I). Mối tương quan của Spearman đã xác định mối tương quan tích cực giữa CXCL5 và axit uric và IL-1β trong huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính (Hình. 10J–K). Do đó, chúng tôi đã xác định biểu hiện CXCR2 trong tế bào thần kinh DRG ở người và tăng nồng độ CXCL5 trong huyết thanh ở bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính, cho thấy sự liên quan tiềm ẩn của CXCL5-neuronal CXCR2-TRPA1 báo hiệu đối với đau khớp và viêm của bệnh nhân gút.

**Hình 10: CXCR2 được biểu hiện trong tế bào thần kinh DRG ở người và CXCL5 tăng trong huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính.**

Sự thảo luận

CXCL5 là một chất hấp dẫn hóa học bạch cầu trung tính mạnh bằng cách liên kết với CXCR2 bạch cầu trung tính. Một nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng biểu hiện CXCL5 đã tăng đáng kể trong da của chuột mô hình đau viêm do UVB gây ra và trong da người tiếp xúc với UVB¹⁹. Trung hòa CXCL5 làm giảm đáng kể dị ứng cơ học của chuột mô hình đau viêm do UVB gây ra, chứng tỏ vai trò quan trọng của CXCL5 trong việc làm trung gian giảm đau da do UVB¹⁹. Tiêm CXCL5 gây thâm nhiễm bạch cầu trung tính và đại thực bào. Nhưng cơn đau do CXCL5 gây ra xảy ra sớm hơn nhiều so với thâm nhiễm bạch cầu¹⁹, cho thấy CXCL5 có thể tác động trực tiếp lên các tế bào thần kinh cảm giác. Tuy nhiên, vẫn còn thiếu bằng chứng ủng hộ quan điểm này. Ở đây chúng tôi thấy rằng ứng dụng tắm của CXCL5 tạo ra Ca rõ ràng²⁺ thoáng qua trong tế bào thần kinh DRG của chuột. Dược lý kết hợp với các phương pháp di truyền cho thấy CXCL5 tác động lên CXCR2 để kích hoạt TRPA1. CXCL5 tạo ra sự khử cực màng và tăng tính dễ bị kích thích trong các tế bào thần kinh DRG thông qua các cơ chế phụ thuộc CXCR2 và TRPA1. Kết quả của chúng tôi chứng minh rằng CXCL5 có thể tác động lên CXCR2 để kích hoạt TRPA1 và tạo ra sự kích thích quá mức của tế bào thần kinh DRG.

Nghiên cứu trước đây cho thấy Gβγ có thể đóng vai trò là tín hiệu xuôi dòng của GPCR để kích hoạt TRPA1^33,34. Nhưng làm thế nào Gβγ hoạt động để kích hoạt TRPA1 vẫn chưa được biết. Gβγ điều chỉnh hoạt động của kênh thông qua liên kết trực tiếp với kênh hoặc thông qua việc kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào^40,41. Chúng tôi đã sử dụng hệ thống HEK293T và khám phá cơ sở sinh hóa làm cơ sở cho cách CXCR2 kích hoạt TRPA1. Trước tiên, chúng tôi đã xác nhận đóng góp của Gβγ bằng cách chỉ ra rằng cô lập Gβγ hoặc hạ gục Gβ làm giảm kích hoạt TRPA1 qua trung gian CXCR2. Tuy nhiên, việc chặn tín hiệu nội bào liên quan đến Gβγ không có tác dụng. Co-IP xác nhận liên kết của Gβ với TRPA1 được tăng lên khi kích hoạt CXCR2. Kết quả này cho thấy Gβγ liên kết với TRPA1 khi kích hoạt CXCR2. Sau đó, chúng tôi đã thực hiện kết nối protein-protein để dự đoán mô hình liên kết mTRPA1 và Gβγ. Khu vực chúng tôi dự đoán nơi TRPA1 liên kết với Gβ nằm ở đầu cuối C của chuỗi xoắn TRP⁴². Chúng tôi tiếp tục xác định năm dư lượng chính nằm trong phân đoạn K992-M1018 của mTRPA1 cho thấy tương tác tĩnh điện mạnh với Gβ. Kích hoạt TRPA1 qua trung gian CXCR2 đã giảm đáng kể sau khi đột biến năm dư lượng này. Các kênh đột biến có chức năng kể từ khi AITC gợi lên phản ứng tương tự giữa WT và các kênh đột biến. Cuối cùng, Co-IP xác nhận rằng sự liên kết của TRPA1 với Gβ đã giảm rõ rệt do đột biến của cả năm dư lượng. Chúng tôi suy đoán rằng sự liên kết của Gβ với đoạn K992-M1018 của TRPA1 có thể gây ra chuyển động ra ngoài của chuỗi xoắn TRP, từ đó kéo TM6 trải qua di căn và do đó mở cổng dưới của kênh TRPA1. Nhưng cần lưu ý rằng kích hoạt TRPA1 do CXCR2 gây ra đã không được hoàn thành loại bỏ bởi các đột biến mà chúng tôi đã xác định. Vẫn có khả năng một số khu vực khác cũng có thể đóng góp vào liên kết Gβ với TRPA1 và kích hoạt kênh tiếp theo. Hơn nữa, việc kết nối protein-protein không thể lập bản đồ đầy đủ các chi tiết đầy đủ về tương tác protein; Do đó, các cơ chế vi mô của tương tác protein sẽ cần được giải quyết thêm thông qua kỹ thuật kính hiển vi điện tử cryo.

Theo truyền thống, người ta tin rằng CXCL5 tạo ra chemotaxis trên bạch cầu trung tính thông qua CXCR2 biểu hiện trên bạch cầu trung tính⁵⁰. Ở đây chúng tôi đã xác định được vai trò chưa được xác định trước đây của CXCR2 được thể hiện trong các tế bào thần kinh nociceptor trong hóa trị bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra bằng cách xóa cụ thể Cxcr2 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm. Tính hợp lệ của phương pháp này được chứng minh bằng cách hạ gục cụ thể biểu hiện CXCR2 trong tế bào thần kinh cảm giác nhưng không phải trong bạch cầu trung tính hoặc các mô khác. Với sự trợ giúp của chủng chuột này, chúng tôi đã tìm thấy tiêm CXCL5 trong thực vật gợi ra viêm thần kinh rõ ràng và tuyển dụng bạch cầu trung tính phụ thuộc vào CXCR2 tế bào thần kinh. Viêm thần kinh do CXCL5 gây ra cũng phụ thuộc vào TRPA1 và có thể bị chặn bởi CGRP và các chất đối kháng thụ thể P. Chúng tôi tìm thấy CXCR2 phần lớn đồng biểu hiện với các tế bào thần kinh CGRP DRG, cho thấy CXCL5 có thể kích hoạt CXCR2 thần kinh để kích hoạt giải phóng neuropeptide. Thật vậy, chúng tôi thấy rằng CXCL5 có thể kích hoạt CXCR2 thần kinh và kích hoạt giải phóng CGRP và SP trong các mô chân sau và tế bào thần kinh DRG. CGRP và SP là các neuropeptide có thể tạo ra sự giãn mạch mạnh và thoát mạch huyết tương bằng cách tác động lên các thụ thể CGRP và SP NK1 biểu hiện trên các mạch máu⁺^51,52. Ngăn chặn dược lý các thụ thể CGRP và SP NK1 làm giảm đáng kể việc tuyển dụng bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra. Do đó, những phát hiện này đã làm sáng tỏ sự đóng góp chưa được xác định trước đây của CXCR2 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm đối với hóa trị bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra.

Thâm nhiễm bạch cầu trung tính là dấu hiệu của viêm khớp gút cấp tính^49,53. Bạch cầu trung tính xâm nhập tạo ra một lượng lớn ROS và giải phóng các chất trung gian gây viêm góp phần gây ra bệnh gút, viêm khớp, đau và viêm;^10,14. Dòng bạch cầu trung tính do MSU gây ra xảy ra thông qua cách phụ thuộc CXCR2¹⁵. Theo những phát hiện chúng tôi thu được từ CXCL5, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra sự đóng góp của CXCR2 tế bào thần kinh đối với thâm nhiễm bạch cầu trung tính trong viêm khớp do gút. Chúng tôi nhận thấy thâm nhiễm bạch cầu trung tính đã giảm đáng kể ở SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} Chuột. CGRP và SP đã tăng đáng kể ở khớp mắt cá chân của chuột mẫu bệnh gút. Quan trọng hơn, sự gia tăng CGRP và SP phụ thuộc vào CXCR2 tế bào thần kinh. Đối kháng dược lý CGRP hoặc thụ thể NK1 làm giảm mạnh thâm nhiễm bạch cầu trung tính ở khớp mắt cá chân của chuột mô hình viêm khớp do gút. Do đó, những kết quả này chứng minh rằng kích hoạt CXCR2 tế bào thần kinh dẫn đến giải phóng CGRP và SP, gây viêm thần kinh và thoát mạch huyết tương và do đó góp phần xâm nhập bạch cầu trung tính trong viêm khớp do gút. Nghiên cứu của chúng tôi chứng minh sự đóng góp quan trọng của CXCR2 thể hiện trong các tế bào thần kinh nociceptor đối với thâm nhiễm bạch cầu trung tính trong viêm khớp do gút.

Biểu hiện CXCR2 đã được điều hòa trong các tế bào thần kinh DRG trong tình trạng viêm khớp do bệnh gút. Sự kết hợp của CXCR2 với TRPA1 hoặc ngược lại đã được tăng cường đáng kể trong các tế bào thần kinh DRG của chuột mô hình viêm khớp bệnh gút. Ca do CXCL5 gây ra²⁺ đáp ứng đã tăng lên ở các tế bào thần kinh DRG được phân lập từ chuột mô hình viêm khớp do gút so với chuột đối chứng. Những kết quả này chỉ ra rằng CXCL5 tạo ra sự kích hoạt TRPA1 mạnh hơn thông qua CXCR2 thần kinh trong tế bào thần kinh DRG trong viêm khớp do bệnh gút. Phát hiện này chỉ ra rằng CXCL5 được giải phóng trong viêm khớp do gút có thể gây đau nhiều hơn và viêm thần kinh bằng cách tác động lên CXCR2 tế bào thần kinh được điều hòa. Tuy nhiên, các cơ chế làm cơ sở cho việc điều chỉnh tín hiệu CXCL5-CXCR2 đang chờ điều tra thêm. Có thể việc kích hoạt một dòng thác tín hiệu bởi một số chất trung gian gây viêm có thể thúc đẩy biểu hiện quá mức CXCR2 của tế bào thần kinh trong viêm khớp do gút.

Ở đây chúng tôi thấy rằng CXCL5 tăng đáng kể trong huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp do gút. Nồng độ CXCL5 trong huyết thanh tương quan tích cực với urat và một số dấu hiệu viêm cổ điển, ví dụ: IL-1β. Chúng tôi cũng xác định biểu hiện CXCR2 trong tế bào thần kinh DRG của con người. Sử dụng các tế bào HEK293T như một hệ thống biểu hiện dị thể, chúng tôi đã chỉ ra rằng protein CXCL5 tái tổ hợp của con người kích hoạt TRPA1 mạnh mẽ của con người thông qua tác động lên CXCR2 của con người. Những phát hiện này chứng minh ý nghĩa lâm sàng và dịch thuật của nghiên cứu của chúng tôi. Những con chuột loại trực tiếp toàn cầu Cxcr2 cũng cho thấy giảm đáng kể chứng dị ứng cơ học và viêm khớp trong các trường hợp viêm khớp do bệnh gút. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng chuột loại trực tiếp toàn cầu Cxcr2 biểu hiện sự thiếu hụt rõ ràng trong việc chữa lành vết thương do giảm tân mạch⁵⁴. Do đó, chiến lược hạ gục Cxcr2 đặc hiệu cho tế bào thần kinh có thể đại diện cho một cách tiếp cận hợp lý để quản lý viêm khớp do gút với tính đặc hiệu hơn trên các tế bào thần kinh cảm giác bẩm sinh khớp.

Chúng tôi thấy rằng trung hòa CXCL1 hoặc CXCL2 chỉ cho thấy tác dụng cải thiện viêm khớp mắt cá chân chứ không phải đau khớp, trong khi trung hòa CXCL5 cải thiện cả đau và viêm mắt cá chân của chuột mô hình viêm khớp do gút. CXCL1, 2 và 5 liên kết với CXCR2 để tạo ra hiệu ứng sinh học. Chúng tôi đã sử dụng Ca²⁺ hình ảnh để so sánh thêm khả năng kích thích tế bào thần kinh DRG của chúng. Chúng tôi thấy rằng trong số các chemokine này, CXCL5 tạo ra sự kích hoạt tế bào thần kinh DRG rõ ràng nhất, mạnh hơn đáng kể so với CXCL1. Ngược lại, CXCL2 không tạo ra kích hoạt nào cả. Chúng tôi xác nhận thêm rằng cả tác dụng kích hoạt của CXCL5 và CXCL1 đối với tế bào thần kinh DRG đều phụ thuộc vào CXCR2. Phát hiện này ngụ ý rằng CXCL5 có thể mạnh hơn CXCL1 hoặc CXCL2 trong việc tạo ra tín hiệu nociceptive trong viêm khớp do gút. RNA-Seq tiết lộ thêm rằng biểu hiện CXCL5 được điều chỉnh nhiều nhất trong số các chemokine này ở khớp mắt cá chân của chuột mô hình. Về biểu hiện tương đối cao của CXCL5 ở khớp mắt cá chân bị viêm và hiệu lực cao của nó trong các tế bào thần kinh cảm giác thú vị, trung hòa CXCL5 có thể tạo ra hiệu quả cải thiện hiệu quả nhất đối với cả đau và viêm ở chuột mẫu bệnh gút. Các nghiên cứu sâu hơn sẽ là cần thiết để điều tra kỹ lưỡng các cơ chế cơ bản tiềm năng khác nhau của các chemokine này để kích hoạt CXCR2 tế bào thần kinh.

Chúng tôi đã quan sát thấy một số phản ứng đau còn sót lại vẫn còn trong SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} Chuột. Điều này có thể là do tính chất phức tạp của khớp bị viêm của viêm khớp do gút. Trong quá trình viêm, nhiều cytokine hoặc chemokine gây viêm được giải phóng để góp phần gây đau tổng thể và viêm viêm khớp do gút. Ví dụ, chúng tôi thấy rằng IL-33, một cytokine gây viêm, tăng đáng kể ở khớp mắt cá chân bị viêm và góp phần gây đau viêm khớp do gút bằng cách thúc đẩy sản xuất ROS phụ thuộc bạch cầu trung tính và kích hoạt kênh TRPA1 thông qua thụ thể ST2¹⁴. Chúng tôi cũng thấy rằng IL-1β được tạo ra thông qua viêm NLRP3 trong viêm khớp do gút góp phần gây đau viêm khớp do gút bằng cách thúc đẩy biểu hiện quá mức kênh TRPV1 trong các tế bào thần kinh cảm giác^24,55. Bên cạnh đó, stress oxy hóa được tạo ra trong viêm khớp do gút có thể kích hoạt trực tiếp TRPA1 trong các tế bào thần kinh cảm giác để kích hoạt cơn đau ở chuột mô hình bệnh gút⁵⁶. Một nghiên cứu gần đây cũng nhấn mạnh vai trò quan trọng của sự tham gia của đại thực bào TRPV4 trong đau và viêm bệnh gút¹¹. Ở đây chúng tôi cũng quan sát thấy Il6 là gen cytokine được điều hòa cao nhất. IL-6 có thể thúc đẩy biểu hiện chức năng của TRPV1 trong tế bào thần kinh DRG và góp phần vào sự nhạy cảm ngoại biên⁵⁷. Có khả năng tín hiệu qua trung gian IL-6 cũng có thể góp phần gây đau gút. Do đó, có nhiều con đường tín hiệu tiềm năng khác liên quan đến đau viêm khớp do gút, phản ánh sự phức tạp của cơ chế đau viêm khớp do gút.

Chúng tôi đề xuất rằng CXCL5 được giải phóng trong khớp trong viêm khớp do gút tác động lên CXCR2 thể hiện trong các tế bào thần kinh cảm giác bảo tồn khớp để kích hoạt TRPA1 thông qua tín hiệu Gβγ, dẫn đến khử cực màng và tăng kích thích tạo ra tín hiệu đau. Biểu hiện của CXCR2 và khớp nối với TRPA1 tăng lên trong điều kiện viêm khớp do gút. Kích hoạt TRPA1 trong nociceptor peptidergic tiếp tục kích hoạt Ca²⁺ dòng chảy tạo điều kiện cho neuropeptide CGRP và giải phóng SP. Các neuropeptide này tác động lên thụ thể CGRP và thụ thể SP NK1 trong các mạch máu gần đó để kích hoạt giãn mạch mạnh và thoát mạch huyết tương tạo điều kiện cho hóa trị bạch cầu trung tính do CXCL5 gây ra từ mạch máu đến vị trí viêm. Các bạch cầu trung tính thâm nhiễm giải phóng ROS và các chất trung gian gây viêm góp phần gây đau gút và viêm khớp^14,15. Do đó, chúng tôi đã làm sáng tỏ vai trò quan trọng của trục CXCL5-neuronal CXCR2–TRPA1 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm bẩm sinh khớp để thúc đẩy đau viêm khớp do gút cấp tính và viêm khớp (Hình bổ sung. 11). Chúng tôi đề xuất rằng nhắm mục tiêu cụ thể CXCR2 trong các tế bào thần kinh cảm giác bẩm sinh khớp có thể là một chiến lược tiềm năng để quản lý viêm khớp do gút trong tương lai.

Phương pháp

Phê duyệt nghiên cứu

Tất cả các quy trình và quy trình sử dụng động vật được áp dụng theo các giao thức được phê duyệt bởi Ủy ban Đánh giá Đạo đức Phúc lợi và Quản lý Động vật Phòng thí nghiệm của Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang (Giấy phép số #IACUC-20190819-04). Tất cả những nỗ lực đã được thực hiện để giảm thiểu số lượng và sự đau khổ của động vật được sử dụng. Việc thu thập các mẫu lâm sàng được thực hiện theo Tuyên bố của Helsinki và được Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện trực thuộc thứ hai của Đại học Y Hà Bắc phê duyệt (#2022-R282). Các mẫu huyết thanh được lấy từ các mẫu còn sót lại từ các phòng thí nghiệm chẩn đoán với nguy cơ gây hại đủ nhỏ cho bệnh nhân và nghiên cứu mang tính quan sát; do đó, Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện trực thuộc thứ hai của Đại học Y Hà Bắc đã từ bỏ yêu cầu về sự đồng ý có hiểu biết. Việc thu thập các mẫu DRG sau khi chết của con người được thực hiện với sự chấp thuận của Ủy ban Đạo đức của Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang (#ZJ-2161934-1).

Động vật

C57BL/6 (6–8 tuần, đực) được mua từ Trung tâm Động vật thí nghiệm Thượng Hải, Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc. Cxcr2^−/− và Cxcr2^{fl / fl} chuột được tạo tùy chỉnh bởi GemPharmatech (Nam Kinh, Trung Quốc). Chuột knock-in Ly6g-IRES-GFP được tạo tùy chỉnh thông qua kỹ thuật RNA dẫn hướng liên quan đến Cas9 (gRNA) của Trung tâm Sinh vật Mô hình Thượng Hải, Inc. (Thượng Hải, Trung Quốc). Trpv1^−/− và Trpa1^−/− Chuột được cung cấp bởi Giáo sư Zhen-zhong Xu (Đại học Y khoa Chiết Giang). Chuột SNS-Cre (C57BL / 6) được cung cấp bởi Giáo sư Xu Zhang (Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc, Thượng Hải, Trung Quốc). Cxcr2^{fl / fl} chuột được lai với chuột SNS-Cre để tạo SNS-Cre Cxcr2^{fl / fl} chuột (đực và cái). Cxcr2^{fl / fl} Chuột (đực và cái) được sử dụng làm đối chứng tiêu cực. Trình tự của mồi được sử dụng cho kiểu gen chuột có thể được tìm thấy trong Bảng S1. Động vật được nuôi trong Trung tâm Động vật Phòng thí nghiệm của Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang. Thực phẩm và nước uống có sẵn ad libitum. Những con chuột được duy trì trong môi trường không có mầm bệnh theo chu kỳ sáng / tối 12 giờ ở nhiệt độ được kiểm soát (24 ± 2 ° C) và độ ẩm (50 60%). Thức ăn là chow chuột tiêu chuẩn (chứa protein 18%, chất béo 5% và chất xơ 5%). Việc báo cáo các thí nghiệm trên động vật tuân thủ hướng dẫn ARRIVE. Tất cả những nỗ lực đã được thực hiện để giảm thiểu sự đau khổ của động vật trong các thí nghiệm. ĐỒNG₂ Hít phải được sử dụng cho cái chết êm dịu của động vật.

Huyết thanh bệnh nhân viêm khớp gút và lấy DRG sau khi chết ở người

Các bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh viêm khớp do gút dựa trên tiêu chí phân loại của Đại học Thấp khớp Hoa Kỳ⁵⁸ và đáp ứng các tiêu chí: (1) nam 20–60 tuổi; (2) đã được nhập viện trong vòng 72 giờ sau khi bắt đầu một cuộc tấn công bệnh gút cấp tính; (3) nồng độ uric huyết thanh ≥ 420 μM. 37 bệnh nhân đã được đưa vào nghiên cứu này. Viêm khớp do gút là một bệnh chiếm ưu thế ở nam giới. Bệnh nhân nữ rất khó tuyển dụng tại các phòng khám trong khung thời gian. Do đó, chỉ có bệnh nhân nam được đưa vào. Những bệnh nhân này không có tình trạng viêm nào khác và không dùng bất kỳ loại thuốc chống viêm nào trong thời gian này. 31 nam giới phù hợp với độ tuổi đã được đưa vào như là đối chứng khỏe mạnh. Các mẫu huyết thanh được thu thập trong ống EDTA và ly tâm (2000 × g, 10 phút), và supernatant được giữ dưới -20 ° C để phân tích thêm. Tất cả các mẫu đã được sử dụng và phân tích ẩn danh. Các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân viêm khớp do gút và các biện pháp kiểm soát khỏe mạnh được cung cấp trong Bảng S2. Các mẫu DRG sau khi chết của con người được thu thập từ việc hiến tặng cơ thể cho Khoa Giải phẫu người, Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang.

Thiết lập mô hình chuột viêm khớp do gút do MSU

Mô hình viêm khớp do gút được thiết lập thông qua tiêm tinh thể MSU trong khớp (500 μg) lơ lửng trong PBS không có nội độc tố (20 μl) vào khớp mắt cá chân của chuột dưới gây mê isoflurane như được mô tả trước đây^23,24. Chuột đối chứng được tiêm (tức là) với một khối lượng PBS vô trùng bằng nhau. Việc thiết lập thành công mô hình được xác định bởi sự phát triển của chứng dị ứng cơ học và sưng mắt cá chân 2 giờ sau khi tiêm MSU, như đã báo cáo⁵⁶.

Kiểm tra hành vi động vật và đánh giá đường kính mắt cá chân

Allodynia cơ học

Chuột được đặt riêng trong buồng quan sát trong suốt trên sàn lưới kim loại cao và quen trong ít nhất 30 phút trước khi thử nghiệm. Các sợi von Frey được áp dụng vuông góc với khu vực gót chân của chân sau cùng bên như được mô tả trong nghiên cứu gần đây của chúng tôi^14,59. Mô hình thử nghiệm “lên-xuống” được sử dụng để xác định ngưỡng rút chân (PWT) và ngưỡng rút chân 50% (PWT) được tính bằng thử nghiệm Dixon không tham số.

Kiểm tra trường mở

Chiếu sáng 20 LX đã được áp dụng cho trường mở. Những con chuột được đặt trong phòng thử nghiệm 30 phút trước khi thử nghiệm để làm quen với môi trường. Những con chuột sau đó được nhẹ nhàng đặt ở trung tâm của cánh đồng mở. Sau 30 giây, phần mềm ANY-maze (Stoelting, Mỹ) đã bắt đầu ghi lại hoạt động của chuột và dữ liệu được phân tích sau đó ngoại tuyến.

Phân tích dáng đi

Dáng đi của chuột được ghi lại và phân tích thông qua hệ thống hình ảnh DigiGait (MouseSpecifics Inc., Mỹ) theo báo cáo⁵⁵. Chuột được đặt trên một máy chạy bộ phẳng và trong suốt được vận hành với tốc độ không đổi (18 cm / s). Một máy quay video được đặt bên dưới máy chạy bộ để ghi lại dáng đi của chuột trong khi chạy. Các con vật chạy trên máy chạy bộ trong 20 giây, và năm bước liên tiếp được tính trung bình cho mỗi con vật và được sử dụng để phân tích dáng đi. Các thông số bao gồm diện tích chân, xích đu, tư thế và chiều dài sải chân được tính toán cho từng con chuột thông qua phần mềm và sau đó được phân tích.

Đường kính mắt cá chân

Đường kính của khớp mắt cá chân được xác định là sự gia tăng đường kính mắt cá chân, được đo bằng thước cặp kỹ thuật số và được tính bằng chênh lệch giữa giá trị cơ bản và giá trị thử nghiệm²⁴. Kết quả được hiển thị là % tăng đường kính mắt cá chân (D) và được tính như sau: % tăng đường kính mắt cá chân = (D_sau–D_trước)/D_trước. Tất cả các bài kiểm tra hành vi và đánh giá khớp mắt cá chân được thực hiện bởi một thí nghiệm bị mù theo nhóm.

Phân tích trình tự RNA và tin sinh học

Chuột được an tử 8 hoặc 24 giờ sau khi tiêm MSU hoặc xe. Các khớp mắt cá chân được tiêm được thu thập, thái hạt lựu và bảo quản trong RNAlater (Thermal Fisher Scientific, Mỹ). Tổng RNA từ xe và nhóm MSU được chiết xuất bằng thuốc thử Trizol (Thermal Fisher Scientific, Mỹ). Chất lượng và độ tinh khiết RNA đã được kiểm nghiệm bởi TapeStation (Agilent, Mỹ) và NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, USA). Chỉ các mẫu RNA cho thấy Số toàn vẹn RNA (RIN) ≥ 8.0 và A260/230 ≥ 1.5 được sử dụng cho RNA-Seq. Các mẫu được giải trình tự gen bởi BGISEQ-500 từ Tập đoàn BGI (Thâm Quyến, Trung Quốc). Các tệp fastq thô được căn chỉnh theo bộ gen tham chiếu mus musculus mm10 cho dữ liệu chuột bằng cách sử dụng bộ chỉnh sửa phiên bản STAR 2.5. Sau khi đọc được ánh xạ tới mm10, chuyển đổi tệp thích hợp (từ định dạng BAM sang định dạng BED) được thực hiện bằng bedtools v2.17.0. Ma trận đếm gen được tạo bằng Rsubread phiên bản 1.30.9. Các tệp đếm sau đó được chuẩn hóa và phân tích thông qua DESeq2 và các tập lệnh R tùy chỉnh. Biểu thức vi phân được xác định bằng cách sử dụng DESeq2. Các ngưỡng quan trọng được xác định như sau: điều chỉnh giá trị p (FDR) < 0,001 và giá trị tuyệt đối của |log₂ (Thay đổi nếp gấp) | > 1.0. Phân tích con đường của các gen biểu hiện khác biệt (DEG) được thực hiện bằng DAVID⁶⁰. Bộ dữ liệu RNA-Seq của điểm thời gian 24 giờ được lấy từ nghiên cứu gần đây của chúng tôi¹⁴ và phân tích lại theo các tiêu chí nêu trên. Tất cả các tệp fastq thô và ma trận đếm biểu thức đã được gửi vào Omnibus biểu hiện gen của Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (số gia nhập GSE242872).

Miễn dịch huỳnh quang

Miễn dịch huỳnh quang được thực hiện bằng giao thức tiêu chuẩn^61,62. Các mẫu đầu tiên được cố định bằng cách sử dụng paraformaldehyde (4%) và chuyển sang gradient sucrose trong 3 ngày để khử nước. Đối với khớp mắt cá chân, khử vôi bằng EDTA lần đầu tiên được thực hiện. Sau khi mất nước, các mẫu vật được cắt thành các phần có độ dày 15 μm bằng máy lạnh (CryoStar, NX50, Thermo Fisher, Hoa Kỳ). Các phần cắt sau đó được gắn vào các slide kính được phủ sẵn gelatin. Huyết thanh lừa 1% BSA + 10% được sử dụng để chặn các phần trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó được ủ với các kháng thể chính (Bảng S1) pha loãng trong dung dịch chặn qua đêm ở 4 ° C. Các phần sau đó được rửa ba lần trong 5 phút trong PBS. Các mô sau đó được ủ với các kháng thể thứ cấp (Donkey anti-rabbit Cy3, Donkey anti-rabbit FITC, Donkey anti-mouse Cy3 và Alexa Fluor 647 Donkey anti-chicken IgG, Bảng S1) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Các phần nhuộm màu và gắn kết sau đó được kiểm tra bằng kính hiển vi Zeiss Apotome 3 (Zeiss, Đức). Các hình ảnh được chụp bằng phần mềm ZEN (Zeiss, Đức). Để tránh các mô nhuộm màu không đặc hiệu, một tế bào được đánh giá là tế bào được dán nhãn dương tính Ly6G hoặc Iba-1 bằng cách mang đồng thời 2 tính năng: (1) nhuộm dương tính với Ly6G hoặc Iba-1; (2) có một hạt nhân được dán nhãn DAPI xác định. Để định lượng, ít nhất ba phần từ mỗi con chuột đã được chọn và tính trung bình như mô tả^63,64. Cường độ huỳnh quang của hình ảnh độ phân giải 1024 × 1024 pixel được đo bằng Hình ảnh J (NIH, USA).

HEK293T nuôi cấy và truyền tế bào

HEK293T tế bào được mua từ ATCC (#CRL-3216) và nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS, 2 mM l-glutamine, 100 U / ml penicillin và 100 μg / ml streptomycin. Nuôi cấy được duy trì với 5% CO₂ trong lồng ấp 37 °C. SiRNA đặc hiệu cho Gβ1 (UACGACGACUUCAACUGCA), Gβ2 (ACGACGACUUCAACUGCAA) và siRNA đối chứng âm tính với bộ giảm thanh được tùy chỉnh bởi RIBOBIO, Trung Quốc. Các bản sao cDNA cho Gαtransducin (Gαt) hoặc miền đầu cuối carboxy của thụ thể kết hợp protein G kinase 2 (GRK2ct) đã được mô tả trước đây^35,36. Chuột và con người TRPA1 là quà tặng từ Tiến sĩ Jordt (Đại học Duke, Mỹ). CXCR2 của chuột và người được mua từ OBiO (Trung Quốc). siRNA hoặc plasmid được truyền vào các tế bào HEK293T bằng cách sử dụng Lipofectamine^TM 2000 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 4 giờ sau khi truyền, môi trường được thay đổi trở lại DMEM + 10% FBS và các tế bào được truyền được nuôi cấy thêm 24–48 giờ trước Ca²⁺ Hình ảnh đã được đưa ra

Nuôi cấy tế bào thần kinh DRG chuột

Hạch rễ lưng chuột (DRG) được mổ xẻ và phân ly bằng dung dịch enzyme chứa 1 mg / ml collagenase A và 2 mg / ml dispase trong DMEM trong 1 giờ ở 37 ° C. Sau khi trituration cơ học và ly tâm, các tế bào thần kinh được nuôi cấy trong DMEM cộng với 10% FBS, 100 U/ml penicillin và 100 μg/ml streptomycin trên kính phủ tám khoang (Nunc, Đan Mạch) phủ poly-d-lysine (Sigma, Hoa Kỳ) và laminin chuột (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ).

Ghi lại kẹp vá toàn tế bào trong tế bào thần kinh DRG

Các bản ghi kẹp vá toàn tế bào được thực hiện trong các tế bào thần kinh DRG nuôi cấy chính với bộ khuếch đại Axopatch-200B và bộ số hóa Digidata 1550B (Axon Instruments, Hoa Kỳ)^44,65. Pipet vá có điện trở 3–5 MΩ được chế tạo từ kính borosilicate cứng bằng cách sử dụng dụng cụ kéo pipet (P-97; Sutter Instruments, Mỹ). Ghi toàn bộ tế bào được thực hiện với dung dịch ngoại bào chứa (mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1, glucose 10 và HEPES 10 (pH 7,4 với NaOH). Dung dịch pipet trong chứa (tính bằng mM): KCl 140, MgCl₂ 1, CaCl₂ 0,5, EGTA 5, HEPES 10 và ATP 3 (pH 7,4 với KOH). Các tiềm năng hành động được gợi lên bằng cách phun dòng điện vào trong 500 ms thông qua điện cực ghi dưới chế độ kẹp hiện tại. Các tế bào thần kinh DRG đường kính nhỏ với Cm <42 pF đã được ghi nhận như trong các nghiên cứu trước đây^43,44,66. Dữ liệu được phân tích bằng Clampfit 10.2 (Axon Instruments).

Ca²⁺ Hình ảnh

Ca phóng xạ dựa trên Fura-2²⁺ Hình ảnh được thực hiện như mô tả trước đây⁶⁷. Đối với Ca²⁺ hình ảnh của các tế bào HEK293, các tế bào được sử dụng trong vòng 48 giờ sau khi truyền. Đối với tế bào thần kinh DRG chuột, tế bào thần kinh được sử dụng 6 giờ sau khi phân ly. Các tế bào được nạp 10 μM Fura-2 AM (Thermo Fisher Scientific, USA) trong bộ đệm tải (chứa 140 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂và 10 HEPES (tính bằng mM), pH 7,4 với NaOH) ở 37 °C trong 45 phút trong bóng tối. Các tế bào sau đó được rửa 3 lần, nghỉ ngơi thêm 30 phút trong bóng tối và sau đó được chụp ảnh. Các hình ảnh tế bào dưới bước sóng kích thích 340 và 380 nm được chụp bằng kính hiển vi Nikon ECLIPSE Ti-S (Nikon, Nhật Bản) với máy đơn sắc Polychrome V (Till Photonics, Mỹ), máy ảnh CCD Orca Flash 4.0 (Hamamatsu, Nhật Bản) và phần mềm MetaFluor (Thiết bị phân tử, Hoa Kỳ). Tỷ lệ Fura-2 (F₃₄₀/F₃₈₀) được sử dụng để phản ánh những thay đổi trong Ca nội bào²⁺ khi kích thích. Các giá trị thu được từ 20 đến 60 ô trong hình ảnh tua nhanh thời gian từ mỗi bìa. Một tế bào được coi là đáp ứng sau thử thách nếu đỉnh Ca²⁺ đáp ứng là trên 20% mức cơ sở như đã báo cáo trước đó⁶⁴.

Western blot

Các mẫu khớp mắt cá chân và DRG L3-L5 cùng bên đã được thu hoạch, sau đó cân và đồng nhất trong dung dịch đệm RIPA được thêm vào với các chất ức chế protease. Supernatant được ly tâm ở 15.000 × g trong 12 phút ở 4 °C. Nồng độ protein của lysates được xác định bằng xét nghiệm BCA. 20 μg protein được nạp vào mỗi làn và tách ra trên gel SDS-PAGE 8%, sau đó chuyển điện di sang màng polyvinyl difluoride 0,45 μm. Các màng được chặn bằng 5% sữa không béo trong dung dịch TBST ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ và sau đó được ủ với các kháng thể chính ở 4 ° C qua đêm. Các kháng thể chính sau đây đã được sử dụng: thỏ anti-CXCR2 (1:1000), thỏ anti-TRPA1 (1:500) và β-actin (1:5000) (Bảng S1). Sau đó, các đốm này được ủ với kháng thể thứ hai liên hợp HRP (1: 5000) trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng (Bảng S1). Mức độ biểu hiện của protein mục tiêu được chuẩn hóa theo mật độ của β-actin. Hình ảnh gel được chụp bởi FluoChem R (Biotechne, Mỹ). Phân tích định lượng được thực hiện với ImageJ (NIH, USA). Bản quét chưa được xử lý của các blot được cung cấp trong tệp Dữ liệu nguồn.

Phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang (FACS)

Các khớp mắt cá chân được thu thập, thái hạt lựu và tiêu hóa với 2 mg / ml dispase và 1 mg / ml collagenase type 1 (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) trong RPMI 1640 + huyết thanh bò thai 10% (FBS) trong 1 giờ ở 37 ° C. Các tế bào được lọc qua bộ lọc tế bào với lưới nylon 70 μm (Corning, Hoa Kỳ) và rửa bằng RPMI 1640 + 10% FBS. Các tế bào sau đó được nhuộm bằng một bảng điều khiển tiêu chuẩn của các kháng thể kiểu hình miễn dịch. Danh sách tất cả các kháng thể được sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong Bảng S1, bao gồm CD11b chống chuột (1:500) và chống chuột Ly6G (1:500), trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi nhuộm, các tế bào được treo với một bộ đệm nhuộm; sau đó, các mẫu được thu thập bằng FACS Canto II Cytometry (BD Biosciences, Hoa Kỳ) và dữ liệu được phân tích bằng phần mềm FlowJo (BD Biosciences, Hoa Kỳ).

Lai tạo tại chỗ

Quá trình lai tại chỗ được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ thuốc thử huỳnh quang ghép kênh RNAscope® v2 (#322300-USM, Advanced Cell Diagnostics, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các đầu dò RNA (Mm-Trpa1-C1, #400211) bổ sung cho các mRNA đích. Trong mỗi thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng đầu dò Hs-ppib (peptidylprolyl isomerase B của con người) và Dapb (dihydrodipicolinate reductase của vi khuẩn) làm đối chứng dương tính và âm tính, tương ứng. Các mẫu đông lạnh cố định (L3-L5 DRGs) được cắt bằng microtome đông lạnh (CryoStar NX50, Thermo Fisher) ở độ dày 10 μm. Tiền lai, lai và giặt được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phần sau đó được sử dụng để nhuộm miễn dịch huỳnh quang để xác nhận sự đồng định vị của Trpa1 và CXCR2 trong các tế bào thần kinh DRG.

Xét nghiệm thoát mạch màu xanh Evans

Để kiểm tra viêm thần kinh ở chân sau, chuột được gây mê bằng isoflurane 5%. 100 μl dung dịch Evans blue (EB) 0,5% được tiêm tĩnh mạch vào chuột gây mê 10 phút trước khi bôi thuốc kích thích thần kinh. AITC (5 mM, 10 μl) hoặc CXCL5 (300 ng, 10 μl) được tiêm bằng cách tiêm trong cây. 3 giờ sau, những con chuột bị hy sinh. Các mô thực vật được thu thập, cân nặng và đặt trong dung dịch axit trichloroacetic 50%, đồng nhất, ly tâm (10.000 × g, 20 phút) và supernatant được trộn với ethanol theo tỷ lệ 1: 3. Hàm lượng EB được định lượng bằng cách đo mật độ quang học ở 620 nm bằng đầu đọc microplate (SpectraMax M4, Thiết bị phân tử, Hoa Kỳ). Độ hấp thụ được bình thường hóa cho mỗi gram trọng lượng mô.

Đồng nhất mô và xét nghiệm Elisa

Chuột được gây mê giai đoạn cuối và các mô khớp mắt cá chân hoặc chân sau được thu thập và thái hạt lựu. Các mô thái hạt lựu được đồng nhất bằng Bullet Blender (NextAdvance, Hoa Kỳ) trong 50 mM Tris-base (pH 7,4) và 150 mM NaCl với chất ức chế protease (# 04693132001, Roche, Thụy Sĩ) và 0,2% Triton-X. Đồng nhất được thực hiện trong 20 phút ở tốc độ tối đa. Các homogenat được ly tâm ở 10.000×g trong 10 phút ở 4 °C. Supernatant đã được thử nghiệm bởi bộ ELISA cho các phân tích sau: CXCL5, SP và CGRP (Bảng S1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các tấm được đọc ở 450 và 570 nm bằng đầu đọc microplate. Tổng protein được xác định bằng xét nghiệm BCA (Thermo Fisher Scientific, USA).

Đo hoạt động myeloperoxidase (MPO)

Việc tuyển dụng bạch cầu trung tính ở khớp mắt cá chân được đánh giá thông qua việc định lượng hoạt động của enzyme MPO bằng cách sử dụng bộ phát hiện MPO thương mại (Elabscience, Hoa Kỳ) như được mô tả trước đây¹⁴. Một thời gian ngắn, chuột được gây mê giai đoạn cuối, và khớp mắt cá chân được đồng nhất hóa và ly tâm ở 10.000 × g ở 4 ° C trong 15 phút. 10 μl chất siêu nhiên được chuyển vào PBS (pH 6.0) chứa 0,17 mg / ml 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine và 0,0005% H₂O₂. MPO xúc tác phản ứng oxy hóa khử của H₂O₂ và 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine và tạo ra các hợp chất màu vàng, và độ hấp thụ ở 460 nm đã được xác định. Hoạt động MPO được tính toán và biểu thị dưới dạng mô U / g. Một đơn vị hoạt động MPO được định nghĩa là lượng enzyme phân hủy 1 μmol H₂O₂ ở 37 °C mỗi g mô ướt.

Đánh giá mô bệnh học khớp mắt cá chân

Mắt cá chân được cố định bằng 10% paraformaldehyde trong PBS và sau đó khử vôi trong 21 ngày với EDTA và nhúng parafin để cắt thêm. Các phần parafin được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H &E) để phân tích hình thái bằng kính hiển vi ánh sáng với mục tiêu ×10 và ×40. Để phân tích mô bệnh học, mức độ của các tham số sau đây được đánh giá như báo cáo⁶⁸: (1) thâm nhiễm viêm (từ 0 = không viêm, 1 = nhẹ, 2 = vừa và 3 = viêm nặng); (2) chấn thương sụn (từ 0 = không có chấn thương, 1 = nhẹ, 2 = trung bình và 3 = chấn thương nặng); (3) tăng sinh mạch máu (từ 0 = không tăng sinh mạch máu, 1 = nhẹ, 2 = trung bình và 3 = tăng sinh mạch máu nặng). Điểm số được xác định bằng cách cộng ba tham số cho mỗi mẫu. Phân tích được thực hiện một cách mù quáng bằng cách sử dụng ×40 mục tiêu. Ba phần được lấy từ mỗi mẫu và sau đó được tính trung bình để có được kết quả.

Xét nghiệm ghép mẫu huyết thanh của con người

Các mẫu huyết thanh được lưu trữ được rã đông và ly tâm ở 10.000 × g trong 5 phút ở 4 ° C để loại bỏ bất kỳ mảnh vụn nào. Các xét nghiệm ghép kênh Luminex (Luminex, Hoa Kỳ), được thiết kế tùy chỉnh, được sử dụng để xác định nồng độ của một bảng cytokine và chemokine gây viêm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, các kháng thể đặc hiệu phân tích được đóng gói trước vào các vi hạt từ tính được nhúng trong fluorophores, với một tỷ lệ phần trăm cụ thể của từng vùng hạt. Các hạt từ tính, chất chuẩn và mẫu được đưa vào giếng và kháng thể cố định liên kết chất phân tích mục tiêu. Sau khi rửa sạch bất kỳ chất không liên kết nào, một hỗn hợp kháng thể biotinyl hóa đặc trưng cho các chất phân tích quan tâm đã được thêm vào mỗi giếng. Sau khi rửa, các cặp vợ chồng streptavidin-phycoerythrin liên kết với các kháng thể biotinyl hóa đã được thêm vào mỗi giếng. Sau một lần rửa khác, các vi hạt được lơ lửng trong bộ đệm và được phân tích bằng máy phân tích Luminex MAGPIX (Luminex, Hoa Kỳ).

Phân lập huyết thanh và xét nghiệm Elisa

Các mẫu máu được thu thập từ mỗi con chuột trước và 3 giờ sau khi tiêm rmCXCL5 và sau đó được xử lý bằng cách ly tâm ở 1000×g trong 15 phút để phân lập huyết thanh. Nồng độ CXCL5 trong các mẫu huyết thanh được xác định bằng Chuột CXCL5 Elisa Kit (Bảng S1) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Tấm được đọc ở 450 nm bằng đầu đọc microplate (Thiết bị phân tử, Hoa Kỳ).

xét nghiệm qPCR

Các mẫu khớp mắt cá chân chuột đã được thu thập và tổng RNA được chiết xuất từ các mô bằng bộ cách ly RNA (TaKaRa Bio Inc, Trung Quốc) và phiên mã ngược thành cDNA bằng Bộ thuốc thử Prime ScriptTM RT (TaKaRa Bio Inc, Trung Quốc). qPCR được thực hiện với hệ thống real-time PCR LightCycler 480 (Roche, Thụy Sĩ) sử dụng LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Thụy Sĩ) với hệ thống phản ứng 20 μl. Việc định lượng tương đối biểu hiện gen đích được thực hiện với phương pháp ngưỡng chu kỳ so sánh được chuẩn hóa theo mức độ của gen vệ sinh β-actin. Tất cả các phản ứng được thực hiện trong triplicate. Giá trị ngưỡng chu kỳ (CT) được suy ra từ phần mềm phân tích bởi Hệ thống LightCycler480. ^△△Phương pháp CT được sử dụng để tính toán sự thay đổi nếp gấp biểu hiện gen^69,70. Trình tự của mồi được sử dụng được cung cấp trong Bảng S1.

Đồng kết tủa miễn dịch (co-IP)

Các DRG L3-L5 hai bên từ chuột được mổ xẻ và sau đó được phân giải trong dung dịch đệm chứa 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA và 0,2% Triton X-100 với hỗn hợp chất ức chế protease. Các quy trình được thực hiện bằng Bộ kết tủa miễn dịch với Hạt từ tính Protein A + G (#P2179M, Beyotime, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các lysat được ly tâm (12.000 × g, 15 phút) ở 4 ° C và 5% chất siêu nhiên được lấy cho một mẫu lysate toàn tế bào. Supernatant còn lại được kết tủa với 1 μg kháng thể ở 4 ° C qua đêm và sau đó, các hạt protein G ở 4 ° C trong 2 giờ. Mẫu kết tủa miễn dịch đã bị biến tính và chuẩn bị cho quá trình immunoblotting.

Tạo đột biến điểm trong kênh TRPA1

Chuột Trpa1 (NM_177781.5) được đưa vào vectơ pCDNA3.1 (pTrpa1-WT) và đột biến 1 (R1012A + R1017A), đột biến 2 (R999A + K1000A + R1004A) và đột biến 3 (R1012A + R1017A + R999A + K1000A + R1004A) plasmid được xây dựng bởi Repobio (Hàng Châu, Trung Quốc). Tất cả các đột biến đã được xác minh bằng trình tự gen.

Mô hình tính toán và mô phỏng

Cấu trúc chuột TRPA1 (mTRPA1) được mô hình hóa bằng chương trình SWISS-MODEL dựa trên cấu trúc của TRPA1 của con người (PDB: 6V9W)⁷¹, có 80% trình tự tương tự. HDOCK được sử dụng để kết nối protein-protein nhanh chóng⁷². Chương trình lắp ghép đầu tiên lấy mẫu các chế độ liên kết giả định giữa hai phương pháp tìm kiếm toàn cầu dựa trên protein và sau đó đánh giá các chế độ được lấy mẫu với chức năng chấm điểm dựa trên kiến thức cho các tương tác protein-protein. Mô hình mTRPA1 được sử dụng làm thụ thể kết nối, cấu trúc tinh thể của dị thể gamma beta protein G (PDB: 6RMV)⁴² được sử dụng làm phối tử để lắp ghép. Chế độ liên kết của dị thể gamma beta protein TRPA1 và G được xác định dựa trên sự kết hợp của cấu trúc phức hợp protein TRPM3 và G và chức năng tính điểm. Tính toán tiềm năng bề mặt tĩnh điện protein được thực hiện bởi bộ giải Poisson-Boltzmann thích ứng (APBS)⁷³. Trực quan hóa và phân tích các tính năng mô hình được thực hiện bởi Mã nguồn mở Pymol (https://pymol.org).

Phân tích thống kê

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng GraphPad Prism 8.0 (Phần mềm GraphPad, Hoa Kỳ). Phân bố chuẩn được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm Shapiro-Wilk, và tính đồng nhất của phương sai được đánh giá bằng thử nghiệm của Levene. Để so sánh giữa 2 nhóm, bài kiểm tra t của Student với bài kiểm tra hai phía (dữ liệu tham số) hoặc bài kiểm tra Mann-Whitney U (dữ liệu không tham số không ghép đôi) đã được áp dụng. Để so sánh dữ liệu giữa 3 nhóm trở lên, phân tích phương sai một hoặc hai chiều (ANOVA) tiếp theo là thử nghiệm sau hoc của Bonferroni (dữ liệu tham số) hoặc thử nghiệm Kruskal-Wallis theo sau là nhiều so sánh của Dunn (dữ liệu phi tham số) đã được áp dụng. Các chi tiết thống kê được ghi lại trong chú giải hình. Ý nghĩa thống kê được chấp nhận khi p < 0,05.

Tóm tắt báo cáo

Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt Báo cáo Danh mục đầu tư Tự nhiên được liên kết với bài viết này.

Tính khả dụng của dữ liệu

Dữ liệu RNA-Seq đã được gửi vào NCBI GEO theo mã gia nhập GSE242872. Các cấu trúc được đề cập trong nghiên cứu này có sẵn trong Ngân hàng dữ liệu protein theo mã gia nhập PDB 6V9W và 6RMV. Bản tóm tắt báo cáo có sẵn dưới dạng tệp Thông tin bổ sung. Dữ liệu gốc trong nghiên cứu này được cung cấp trong tệp Dữ liệu nguồn. Dữ liệu nguồn được cung cấp với bài báo này.

Mã có sẵn

HDOCK được sử dụng để kết nối protein-protein nhanh (http://hdock.phys.hust.edu.cn/). Trực quan hóa và phân tích các tính năng mô hình được thực hiện bởi Mã nguồn mở Pymol (https://pymol.org).

Tham khảo

Dalbeth, N. et al. Bệnh gút. Nat. Linh mục Dis. Prim. 5, 69 (2019).

Bài viết PubMed Học giả Google
Topiwala, A. et al. Hiệp hội bệnh gút với dự trữ não và dễ bị tổn thương đối với bệnh thoái hóa thần kinh. Nat. xã. 14, 2844 (2023).

Bài viết Quảng cáo CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Terkeltaub, R. Cập nhật về bệnh gút: các chiến lược và lựa chọn điều trị mới. Nat. Linh mục Thấp khớp. 6, 30–38 (2010).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Singh, JA Quan điểm của bệnh nhân trong bệnh gút: đánh giá. Curr. Cho rằng. Bệnh thấp khớp. 31, 159–166 (2019).

Bài viết PubMed Học giả Google
Baker, M. &; Perazella, MA NSAID trong CKD: Chúng có an toàn không? Am. J. Thận Dis. 76, 546–557 (2020).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Fardet, L., Kassar, A., Cabane, J. &; Flahault, A. Các tác dụng phụ do corticosteroid gây ra ở người lớn: tần suất, sàng lọc và phòng ngừa. Thuốc Saf. 30, 861–881 (2007).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Richette, P. et al. 2016 cập nhật các khuyến nghị dựa trên bằng chứng EULAR để quản lý bệnh gút. Ann. Rheum. Dis. 76, 29–42 (2017).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Bardin, T. &; van de Laar, MA; Con đường phía trước: cân nhắc lâm sàng thực tế cho việc sử dụng canakinumab ở bệnh nhân viêm khớp do gút khó điều trị. Jt. Cột sống xương 821, eS30–eS32 (2015).

Bài viết Học giả Google
Martin, W. J., Walton, M. &; Harper, J. Các đại thực bào thường trú bắt đầu và thúc đẩy tình trạng viêm trong mô hình phúc mạc chuột monosodium urate monohydrate gây ra tinh thể của bệnh gút cấp tính. Viêm khớp Rheum. 60, 281–289 (2009).

Bài viết PubMed Học giả Google
Chen, R., Yin, C., Fang, J. &; Liu, B. Viêm NLRP3: một mục tiêu điều trị mới nổi cho đau mãn tính. J. Viêm thần kinh. 18, 84 (2021).

Bài viết Học giả Google
Lan, Z. et al. TRPV4 nhạy cảm với cơ học là cần thiết cho viêm do tinh thể. Ann. Rheum. Dis. 80, 1604–1614 (2021).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Mitroulis, I., Kambas, K. &; Ritis, K. Bạch cầu trung tính, IL-1beta và bệnh gút: có mối liên hệ nào không? Semin. Bệnh miễn dịch. 35, 501–512 (2013).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Li, P., Yu, Q., Nie, H., Yin, C. &; Liu, B. IL-33 / ST2 báo hiệu trong đau và ngứa: cơ chế tế bào và phân tử và tiềm năng điều trị. Sinh học. Dược phẩm. 165, 115143 (2023).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Yin, C. et al. IL-33 / ST2 gây ra sản xuất các loại oxy phản ứng phụ thuộc bạch cầu trung tính và làm trung gian đau bệnh gút. Theranostics 10, 12189–12203 (2020).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Amaral, F. A. et al. NLRP3 tuyển dụng bạch cầu trung tính qua trung gian viêm và hypernociception phụ thuộc vào leukotriene B (4) trong mô hình chuột của bệnh gút. Viêm khớp Rheum. 64, 474–484 (2012).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Charo, I. F. &; Ransohoff, R. M. Nhiều vai trò của chemokine và thụ thể chemokine trong viêm. N. Engl. J. Med. 354, 610–621 (2006).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Sói, M. et al. Protein hóa học bạch cầu hạt 2 hoạt động thông qua cả hai thụ thể IL-8, CXCR1 và CXCR2. Eur. J. Miễn dịch. 28, 164–170 (1998).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Metzemaekers, M. et al. Sửa đổi nội sinh của chất hấp dẫn hóa học CXCL5 làm thay đổi việc sử dụng thụ thể và tăng cường hoạt động của nó đối với bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân. Khoa học Tín hiệu. 14, eaax3053 (2021).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Dawes, JM et al. CXCL5 làm trung gian cho cơn đau do chiếu xạ UVB. Khoa học dịch. Med. 3, 90ra60 (2011).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Capucetti, A., Albano, F. &; Bonecchi, R. Nhiều vai trò của chemokine trong sinh học bạch cầu trung tính. Mặt trận. Miễn dịch. 11, 1259 (2020).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Zhang, Z. J., Cao, D. L., Zhang, X., Ji, R. R. &; Gao, Y. J. Chemokine đóng góp vào đau thần kinh: cảm ứng tương ứng của CXCL1 và CXCR2 trong tế bào hình sao tủy sống và tế bào thần kinh. Đau 154, 2185–2197 (2013).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Wang, JG và cộng sự. Chemokine CXCL1 / gen ung thư liên quan đến tăng trưởng làm tăng dòng natri và kích thích tế bào thần kinh trong các tế bào thần kinh cảm giác có đường kính nhỏ. Mol. Đau 4, 38 (2008).

Bài viết PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Torres, R. et al. Tăng huyết áp, viêm màng hoạt dịch và nhiều dấu ấn sinh học của viêm bị ức chế bởi sự ức chế interleukin 1 trong một mô hình động vật mới của viêm khớp do gút. Ann. Rheum. Dis. 68, 1602–1608 (2009).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Âm, C. et al. Eucalyptol làm giảm bớt phản ứng viêm và đau trong mô hình chuột bị viêm khớp do gút. Br. J. Pharm. 177, 2042–2057 (2020).

Bài viết Quảng cáo CAS Học giả Google
Zhang, J. M. &; An, J. Cytokines, viêm và đau. Int. Gây mê. Clin. 45, 27–37 (2007).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Lee, D. et al. CXCL5 tiết ra từ các đại thực bào trong quá trình tiếp xúc lạnh làm trung gian cho mô mỡ trắng chuyển sang màu nâu. J. Lipid Res. 62, 100117 (2021).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Lukacs, N. W. et al. Các tế bào mast sản xuất ENA-78, có thể hoạt động như một chất hấp dẫn hóa học bạch cầu trung tính mạnh trong quá trình viêm đường thở dị ứng. J. Leukoc. Sinh học. 63, 746–751 (1998).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Lin, M., Carlson, E., Diaconu, E. &; Pearlman, E. CXCL1 / KC và CXCL5 / LIX được sản xuất chọn lọc bởi các nguyên bào sợi giác mạc và thâm nhiễm bạch cầu trung tính trung gian đến chất nền giác mạc trong viêm giác mạc LPS. J. Leukoc. Sinh học. 81, 786–792 (2007).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Zamudio-Cuevas, Y. et al. Tinh thể monosodium urate gây ra stress oxy hóa trong synoviocytes của con người. Viêm khớp Res. Ther. 18, 117 (2016).

Bài viết PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Rafikov, R. et al. Endothelin-1 kích thích hoạt động catalase thông qua quá trình phosphoryl hóa qua trung gian PKCdelta của serine 167. Miễn phí Radic. Biol. Med. 67, 255–264 (2014).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Cao, D. L., Qian, B., Zhang, Z. J., Gao, Y. J. &; Wu, X. B. Thụ thể chemokine CXCR2 trong hạch rễ lưng góp phần duy trì cơn đau viêm. Não Res Bull. 127, 219–225 (2016).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Basbaum, A. I. & Menetrey, D. Vàng agglutinin-apoHRP mầm lúa mì: một chất đánh dấu ngược dòng mới cho các nghiên cứu nhãn đơn và nhãn kép bằng kính hiển vi ánh sáng và điện tử. J. Comp. Thần kinh. 261, 306–318 (1987).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Wilson, S. R. et al. TRPA1 là cần thiết cho ngứa qua trung gian thụ thể kết hợp protein G độc lập với histamine, liên quan đến Mas. Nat. Khoa học thần kinh. 14, 595–602 (2011).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Morita, T. et al. HTR7 làm trung gian serotonergic ngứa cấp tính và mãn tính. Tế bào thần kinh 87, 124–138 (2015).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Ford, C. E. et al. Cơ sở phân tử cho sự tương tác của các tiểu đơn vị betagamma protein G với các tác nhân. Khoa học 280, 1271–1274 (1998).

Bài viết Quảng cáo CAS PubMed Học giả Google
Yevenes, G. E. et al. Điều chế chức năng kênh ion hoạt hóa glycine bởi các tiểu đơn vị betagamma G-protein. Nat. Khoa học thần kinh. 6, 819–824 (2003).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Ma, Q. và cộng sự. Hai đột biến xảy ra tự nhiên của GPR103 ở người xác định sai lệch chọn lọc protein G riêng biệt. Sinh học. Sinh lý. Acta Mol. Tế bào Res. 1868, 119046 (2021).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Rajanala, K. &; Wedegaertner, P. B. Gβγ tín hiệu điều chỉnh sự kiểm soát phụ thuộc vào vi ống đối với tính toàn vẹn của Golgi. Ô. Tín hiệu. 106, 110630 (2023).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Hinman, A., Chuang, H. H., Bautista, D. M. &; Julius, D. Kích hoạt kênh TRP bằng cách sửa đổi cộng hóa trị thuận nghịch. Proc. Natl Acad. Sci. Hoa Kỳ 103, 19564–19568 (2006).

Bài viết Quảng cáo CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Chung, Y. K. &; Wong, Y. H. Kiểm tra lại ‘Mô hình phân ly’ của hoạt hóa protein G từ góc độ tín hiệu Gβγ. THÁNG HAI J. 288, 2490–2501 (2021).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Senarath, K. et al. Điều hòa tín hiệu protein G βγ. Quốc tế Rev. Tế bào Mol. Biol. 339, 133–191 (2018).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Behrendt, M. et al. Cơ sở cấu trúc cho một công tắc bật-tắt điều khiển sự ức chế qua trung gian Gβγ của các kênh TRPM3. Proc. Natl Acad. Sci. Hoa Kỳ 117, 29090–29100 (2020).

Bài viết Quảng cáo CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Lopez-Santiago, L. F. et al. Tiểu đơn vị beta2 kênh natri điều chỉnh các kênh natri nhạy cảm với tetrodotoxin trong các tế bào thần kinh hạch rễ lưng nhỏ và điều chỉnh phản ứng với cơn đau. J. Khoa học thần kinh. 26, 7984–7994 (2006).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Hu, Q. et al. Kênh TRPV1 góp phần vào quá mẫn cảm hành vi trong mô hình chuột của hội chứng đau khu vực phức tạp loại 1. Mặt trước. Pharm. 10, 453 (2019).

Bài viết CAS Học giả Google
Stirling, L. C. et al. Xóa gen đặc hiệu Nociceptor bằng cách sử dụng chuột tái tổ hợp NaV1.8-Cre dị hợp tử. Đau 113, 27–36 (2005).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Obeidat, A. M. et al. Piezo2 biểu hiện nociceptors làm trung gian nhạy cảm cơ học trong viêm xương khớp thực nghiệm. Nat. xã. 14, 2479 (2023).

Bài viết Quảng cáo CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Schlereth, T. et al. Tương tác của peptide liên quan đến gen calcitonin (CGRP) và chất P (SP) trong da người. Neuropeptide 59, 57–62 (2016).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Hughes, C. E. &; Nibbs, RJ B. Hướng dẫn về chemokine và thụ thể của chúng. THÁNG HAI J. 285, 2944–2971 (2018).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Galvao, I. et al. Yếu tố ức chế di chuyển đại thực bào thúc đẩy tích tụ bạch cầu trung tính bằng cách tạo điều kiện sản xuất IL-1beta trong mô hình chuột của bệnh gút cấp tính. J. Leukoc. Sinh học. 99, 1035–1043 (2016).

Bài viết CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Rajarathnam, K., Schnoor, M., Richardson, R. M. &; Rajagopal, S. Làm thế nào để chemokine điều hướng bạch cầu trung tính đến vị trí mục tiêu: mổ xẻ các cơ chế cấu trúc và con đường tín hiệu. Ô. Tín hiệu. 54, 69–80 (2019).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X. & Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 94, 1099–1142 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Mashaghi, A. et al. Neuropeptide substance P and the immune response. Cell. Mol. Life Sci. 73, 4249–4264 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Popa-Nita, O. & Naccache, P. H. Crystal-induced neutrophil activation. Immunol. Cell Biol. 88, 32–40 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar
Devalaraja, R. M. et al. Delayed wound healing in CXCR2 knockout mice. J. Investig. Dermatol. 115, 234–244 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar
Wei, H. et al. Electroacupuncture improves gout arthritis pain via attenuating ROS-mediated NLRP3 inflammasome overactivation. Chin. Med. 18, 86 (2023).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Trevisan, G. et al. TRPA1 receptor stimulation by hydrogen peroxide is critical to trigger hyperalgesia and inflammation in a model of acute gout. Free Radic. Biol. Med. 72, 200–209 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar
Fang, D. et al. Interleukin-6-mediated functional upregulation of TRPV1 receptors in dorsal root ganglion neurons through the activation of JAK/PI3K signaling pathway: roles in the development of bone cancer pain in a rat model. Pain 156, 1124–1144 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar
Wallace, S. L. et al. Preliminary criteria for the classification of the acute arthritis of primary gout. Arthritis Rheum. 20, 895–900 (1977).

Article CAS PubMed Google Scholar
Wang, J. et al. CXCL13 contributes to chronic pain of a mouse model of CRPS-I via CXCR5-mediated NF-kappaB activation and pro-inflammatory cytokine production in spinal cord dorsal horn. J. Neuroinflamm. 20, 109 (2023).

Article CAS Google Scholar
Liu, B. et al. Exploring neuronal mechanisms involved in the scratching behavior of a mouse model of allergic contact dermatitis by transcriptomics. Cell. Mol. Biol. Lett. 27, 16 (2022).

Article MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar
Xu, R. et al. Genome-wide expression profiling by RNA-sequencing in spinal cord dorsal horn of a rat chronic postsurgical pain model to explore potential mechanisms involved in chronic pain. J. Pain Res. 15, 985–1001 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Chen, R. et al. Expression profiling of spinal cord dorsal horn in a rat model of complex regional pain syndrome type-I uncovers potential mechanisms mediating pain and neuroinflammation responses. J. Neuroinflamm. 17, 162 (2020).

Article CAS Google Scholar
Hu, Q. et al. Electroacupuncture alleviates mechanical allodynia in a rat model of complex regional pain syndrome type-I via suppressing spinal CXCL12/CXCR4 signaling. J. Pain. 21, 1060–1074 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar
Li, Y. et al. Electroacupuncture alleviates paclitaxel-induced peripheral neuropathic pain in rats via suppressing TLR4 signaling and TRPV1 upregulation in sensory neurons. Int. J. Mol. Sci. 20, 5917 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Liu, B. et al. The acute nociceptive signals induced by bradykinin in rat sensory neurons are mediated by inhibition of M-type K+ channels and activation of Ca²⁺-activated Cl- channels. J. Clin. Investig. 120, 1240–1252 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wang, Q. et al. Fibroblast growth factor 13 stabilizes microtubules to promote Na(+) channel function in nociceptive DRG neurons and modulates inflammatory pain. J. Adv. Res. 31, 97–111 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar
Liu, B. et al. IL-33/ST2 signaling excites sensory neurons and mediates itch response in a mouse model of poison ivy contact allergy. Proc. Natl Acad. Sci. USA 113, E7572–E7579 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Rossaneis, A. C. et al. Ru(bpy)2(NO)SO3](PF6), a nitric oxide donating ruthenium complex, reduces gout arthritis in mice. Front. Pharm. 10, 229 (2019).

Article CAS Google Scholar
Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 25, 402–408 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar
Caceres, A. I. et al. Kênh cation tiềm năng thụ thể thoáng qua phân họ M thành viên 8 kênh làm trung gian cho tác dụng chống viêm của bạch đàn. Br. J. Pharm. 174, 867–879 (2017).

Bài viết CAS Học giả Google
Zhao, J., Lin King, J. V., Paulsen, C. E., Cheng, Y. &; Julius, D. Kích hoạt gợi lên chất kích thích và điều chế canxi của thụ thể TRPA1. Thiên nhiên 585, 141–145 (2020).

Bài viết Quảng cáo CAS PubMed Trung tâm PubMed Học giả Google
Yan, Y., Tao, H., He, J. &; Huang, S. Y. Máy chủ HDOCK để tích hợp protein-protein docking. Nat. Protoc. 15, 1829–1852 (2020).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google
Jurrus, E. et al. Cải tiến bộ phần mềm giải pháp phân tử sinh học APBS. Khoa học protein. 27, 112–128 (2018).

Bài viết CAS PubMed Học giả Google

Tải xuống tài liệu tham khảo

Lời cảm ơn

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Chương trình R&ampD trọng điểm quốc gia của Trung Quốc (2022YFC3500604 đến Boyi L.), Quỹ khoa học tự nhiên tỉnh Chiết Giang (LZ23H270001 đến Boyi L.), Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc (82305369 đến Boyu L., 82105014 đến Q.H., 81873365 đến Boyi L.), Quỹ Khoa học Tự nhiên Tỉnh Chiết Giang (LQ21H270004 đến Boyu L.) và quỹ nghiên cứu từ Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang (2021JKZDZC07 đến Boyi L.). Chúng tôi cảm ơn Giáo sư Zhen-zhong Xu (Đại học Chiết Giang) đã cung cấp Trpa1^−/− và Trpv1^−/− chuột, Giáo sư Naiming Zhou đã cung cấp plasmid Gα-transducin và Viện Khoa học Y khoa Trung Quốc, Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang để được hỗ trợ kỹ thuật.

Thông tin tác giả

Các tác giả này đóng góp như nhau: Chengyu Yin, Boyu Liu, Zishan Dong, Sai Shi.

Tác giả và chi nhánh

Phòng thí nghiệm chính về châm cứu và thần kinh học của tỉnh Chiết Giang, Khoa Sinh học thần kinh và Nghiên cứu châm cứu, Trường Cao đẳng Y tế lâm sàng thứ ba, Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang, Hàng Châu, Trung Quốc

Chengyu Yin, Boyu Liu, Yushuang Pan, Huimin Nie, Yunwen Zhang, Qimiao Hu, Xiaomei Shao, Jianqiao Fang &; Boyi Liu
Khoa Dược, Đại học Y Hà Bắc, Thạch Gia Trang, Trung Quốc

Zishan Dong &; Chuan Wang
Trung tâm Khoa học Biên giới về Sinh học Tổng hợp (Bộ Giáo dục), Phòng thí nghiệm trọng điểm Thiên Tân về chức năng và ứng dụng cấu trúc đại phân tử sinh học, Trường Khoa học Đời sống, Đại học Thiên Tân, Thiên Tân, Trung Quốc

Sai Shi
Khoa Miễn dịch học và Thấp khớp, Bệnh viện thứ hai của Đại học Y Hà Bắc, Thạch Gia Trang, Trung Quốc

Chenxing Peng
Khoa Giải phẫu người, Trường Khoa học Y tế Cơ bản, Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang, Hàng Châu, Trung Quốc

Xiaochen Bi
Học viện Khoa học Y khoa Trung Quốc, Đại học Y khoa Trung Quốc Chiết Giang, Hàng Châu, Trung Quốc

Yến Tài
Trung tâm chẩn đoán nhiễm trùng, Bệnh viện thứ hai của Đại học Y Hà Bắc, Thạch Gia Trang, Trung Quốc

Xuân Vương
Phòng thí nghiệm trọng điểm Lý sinh phân tử, tỉnh Hà Bắc, Viện Lý sinh, Trường Khoa học, Đại học Công nghệ Hà Bắc, Thiên Tân, Trung Quốc

Hải Long An

Đóng góp

Boyi L. đã lên ý tưởng và giám sát dự án. C.Y., X.S., J.F., và C.W. đã thiết kế các thí nghiệm. C.Y., Boyu L., Y.P., H.N., Y.Z., Q.H. và Y.T. đã thực hiện các thí nghiệm trên động vật, nhuộm miễn dịch, Western blot, RNA scope, PCR, ELISA và các thí nghiệm tế bào học dòng chảy. Z.D. thực hiện ghi âm điện sinh lý. C.P., X.W. và X.B. đã xử lý các mẫu huyết thanh người và DRG. S.S. và H.A. thực hiện mô hình cấu trúc. C.Y., Boyu L., Z.D., và S.S. đã phân tích dữ liệu và chuẩn bị các số liệu. C.Y. và Boyi L. đã viết bản thảo gốc của bản thảo.

Tác giả tương ứng

Thư từ của Hải Long An, Jianqiao Fang, Chuan Wang hoặc Boyi Liu.

Tuyên bố đạo đức

Cạnh tranh lợi ích

Các tác giả tuyên bố không có lợi ích cạnh tranh.

Đánh giá ngang hàng

Thông tin đánh giá ngang hàng

Nature Communications cảm ơn Andrea Low, và những người đánh giá ẩn danh khác vì những đóng góp của họ cho đánh giá ngang hàng về công việc này. Một tập tin đánh giá ngang hàng có sẵn.

Thông tin bổ sung

Ghi chú của nhà xuất bản Springer Nature vẫn trung lập đối với các tuyên bố về quyền tài phán trong các bản đồ được công bố và các liên kết thể chế.

Thông tin bổ sung

Tệp đánh giá ngang hàng

Tóm tắt báo cáo

Dữ liệu nguồn

Quyền và quyền

Truy cập Mở Bài viết này được cấp phép theo Giấy phép Quốc tế Creative Commons Ghi công 4.0, cho phép sử dụng, chia sẻ, điều chỉnh, phân phối và sao chép ở bất kỳ phương tiện hoặc định dạng nào, miễn là bạn ghi công thích hợp cho (các) tác giả gốc và nguồn, cung cấp liên kết đến giấy phép Creative Commons và cho biết nếu thay đổi được thực hiện. Hình ảnh hoặc tài liệu của bên thứ ba khác trong bài viết này được bao gồm trong giấy phép Creative Commons của bài viết, trừ khi có quy định khác trong hạn mức tín dụng cho tài liệu. Nếu tài liệu không được bao gồm trong giấy phép Creative Commons của bài viết và mục đích sử dụng của bạn không được phép theo quy định luật định hoặc vượt quá mức sử dụng được phép, bạn sẽ cần phải xin phép trực tiếp từ chủ bản quyền. Để xem bản sao của giấy phép này, hãy truy cập http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

In lại và cấp quyền

Về bài viết này

Trích dẫn bài viết này

Yin, C., Liu, B., Dong, Z. et al. CXCL5 kích hoạt CXCR2 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm để gây đau khớp và viêm trong viêm khớp do gút thực nghiệm. Nat xã 15, 3263 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-47640-7

Tải xuống trích dẫn

Nhận09 Tháng Hai 2023
Chấp nhận08 Tháng Tư 2024
Công bố16 Tháng Tư 2024
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-024-47640-7

Source link

CXCL5 kích hoạt CXCR2 trong các tế bào thần kinh cảm giác về đêm để gây đau khớp và viêm trong viêm khớp do gút thực nghiệm

Tổng quan

Giới thiệu

Kết quả

CXCL5 tăng cao ở khớp mắt cá chân bị viêm của chuột mô hình viêm khớp do gút và góp phần gây đau khớp và viêm

Thụ thể CXCL5 CXCR2 được biểu hiện trong các tế bào thần kinh DRG bẩm sinh khớp mắt cá chân chuột

CXCL5 / CXCR2 báo hiệu chức năng cặp với kênh TRPA1 trong tế bào thần kinh DRG của chuột

Khám phá cơ sở sinh hóa làm cơ sở cho hoạt hóa TRPA1 qua trung gian CXCR2

CXCL5 khử cực và kích thích các tế bào thần kinh DRG về đêm thông qua cơ chế phụ thuộc CXCR2 và TRPA1

CXCR2 biểu hiện trong các tế bào thần kinh DRG về đêm góp phần gây đau cơ học và viêm khớp do CXCL5 gây ra

CXCR2 tế bào thần kinh góp phần gây viêm thần kinh do CXCL5 và hóa trị bạch cầu trung tính

Biểu hiện CXCR2 thần kinh và khớp nối của nó với TRPA1 được tăng cường trong trường hợp viêm khớp do gút

CXCR2 thần kinh góp phần gây đau viêm khớp do bệnh gút, viêm khớp và suy giảm dáng đi

CXCR2 được biểu hiện trong tế bào thần kinh DRG ở người và CXCL5 tăng trong huyết thanh của bệnh nhân viêm khớp gút cấp tính

Sự thảo luận

Phương pháp

Phê duyệt nghiên cứu

Động vật

Huyết thanh bệnh nhân viêm khớp gút và lấy DRG sau khi chết ở người

Thiết lập mô hình chuột viêm khớp do gút do MSU

Kiểm tra hành vi động vật và đánh giá đường kính mắt cá chân

Allodynia cơ học

Kiểm tra trường mở

Phân tích dáng đi

Đường kính mắt cá chân

Phân tích trình tự RNA và tin sinh học

Miễn dịch huỳnh quang

HEK293T nuôi cấy và truyền tế bào

Nuôi cấy tế bào thần kinh DRG chuột

Ghi lại kẹp vá toàn tế bào trong tế bào thần kinh DRG

Ca2+ Hình ảnh

Western blot

Phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang (FACS)

Lai tạo tại chỗ

Xét nghiệm thoát mạch màu xanh Evans

Đồng nhất mô và xét nghiệm Elisa

Đo hoạt động myeloperoxidase (MPO)

Đánh giá mô bệnh học khớp mắt cá chân

Xét nghiệm ghép mẫu huyết thanh của con người

Phân lập huyết thanh và xét nghiệm Elisa

xét nghiệm qPCR

Đồng kết tủa miễn dịch (co-IP)

Tạo đột biến điểm trong kênh TRPA1

Mô hình tính toán và mô phỏng

Phân tích thống kê

Tóm tắt báo cáo

Tính khả dụng của dữ liệu

Mã có sẵn

Tham khảo

Lời cảm ơn

Thông tin tác giả

Tác giả và chi nhánh

Đóng góp

Tác giả tương ứng

Tuyên bố đạo đức

Cạnh tranh lợi ích

Đánh giá ngang hàng

Thông tin đánh giá ngang hàng

Thông tin bổ sung

Thông tin bổ sung

Dữ liệu nguồn

Quyền và quyền

Về bài viết này

Trích dẫn bài viết này

Chia sẻ bài viết này

Related

Latest Articles

Related Articles

Ca²⁺ Hình ảnh